利用携带GFP的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

本实验的总体目标是通过逆转录病毒介导的OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc过表达，并结合GFP报告系统，生成人类诱导多能干细胞（iPS细胞）。首先加入适量的表达GFP的单个逆转录病毒，随后将感染了GFP表达病毒的细胞转移至经0.1%明胶包被并含有小鼠胚胎成纤维细胞的培养板中。

该实验步骤的第三步是用人类胚胎干细胞培养基替换原有培养基。最后，分离出GFP沉默的诱导性多能干细胞（iPS）克隆，这些克隆的形态与人类胚胎干细胞相似。最终结果通过免疫荧光染色和实时定量聚合酶链式反应（R-T-Q-P-C-R）显示内源性多能性标志物的表达。

该技术相较于现有方法（如使用多能性表面标志物进行活体染色并观察形态学变化）的主要优势在于理想的 iPad。可通过 GFP 表达的丢失作为多能性细胞的标志，从而易于分离细胞克隆。开始培养时，在感染前一天将人成纤维细胞接种于成纤维细胞培养基中：将一乘以十的五次方个人成纤维细胞接种至六孔板的一个孔中；次日，吸除培养基以去除死细胞，并加入两毫升新鲜成纤维细胞培养基，其中含有每毫升五微克的硫酸鱼精蛋白。

然后根据感染复数为五的要求，小心加入相应量的表达GFP的病毒。感染后一天，在37摄氏度下将细胞培养过夜。移除病毒上清液，用2毫升PBS洗涤三次。

然后在感染后第三天加入 2 毫升成纤维细胞培养基。观察 GFP 荧光，并在次日补充 2 毫升成纤维细胞培养基。随后，将经照射的小鼠胚胎成纤维细胞或甲醇处理的饲养细胞以每平方厘米 1 × 10⁴ 个细胞的密度，接种于已包被 0.1% 明胶的 10 厘米培养皿中，培养基为成纤维细胞培养基。

将细胞在37摄氏度下孵育过夜。次日，用1毫升0.05%胰蛋白酶EDTA在37摄氏度下处理5分钟，使感染的人成纤维细胞脱落，并在200 ×g下离心5分钟。用10毫升成纤维细胞培养基重悬细胞，并将细胞重新接种至预先用0.1%明胶和mfs包被的培养皿中，24小时后观察。

更换为 HESC 培养基，并每天更换培养基。感染后 20 至 27 天，在荧光显微镜下观察到类似 ESC 的克隆出现。检查呈现类似 HSC 形态的克隆中是否无 GFP 荧光。

使用10微升移液器，挑取单个IPSC克隆，并将其放入经明胶和甲醇酸包被的12孔板中的一个孔内，加入HESC培养基。每天更换培养基，通过加入一毫升DMEM/F12洗涤培养板来传代细胞。

然后加入 0.5 毫升胶原酶，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。用 DMEM/F12 培养基洗涤细胞两次。接着，加入 2 毫升新鲜的 hESC 培养基。

然后使用细胞刮将集落打散成小块，并从培养板上脱离剩余的细胞。将重悬的集落碎片转移至经明胶和MEF包被的六孔板中的一个孔内，在37摄氏度下孵育两天。

通过免疫荧光检测细胞。用 PBS 洗涤细胞三次，室温下用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。用 PBS 轻柔洗涤细胞三次，再用含 0.2% Triton X-100 的 PBS 处理 30 分钟以进行透化。

用含3% BSA的PBS孵育细胞两小时，以阻断非特异性结合。接着，在4°C条件下，将细胞与一抗共同孵育过夜。然后用PBS洗涤细胞三次，并在避光条件下室温孵育二抗一小时。

在最后一次洗涤时，用 PBS 清洗细胞三次。加入 DAPI，室温孵育五分钟。使用荧光显微镜对细胞进行定量实时成像。

采用RNA提取试剂盒从人成纤维细胞来源的人胰岛样细胞簇（IPCs）中提取总RNA。利用逆转录酶合成第一链cDNA。

然后将其用作qPCR的模板，以检测多能性基因。图中显示的是感染了携带OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc的逆转录病毒混合物的人成纤维细胞BJ株，在重编程过程中第5、10、14和21天观察到的形态学变化。经过21天后，细胞开始呈现类似人胚胎干细胞（HESC）的形态，诱导性多能干细胞（IPCs）可通过GFP荧光识别。

诸如 ESCs 和 IPCs 之类的多能干细胞表达能够抑制前病毒基因表达的分子机制。然而，此处所用的逆转录病毒载体通过逆转录病毒 LTR 表达 GFP 及重编程基因。因此，持续表达 GFP 的细胞被认为在不存在前病毒基因沉默的情况下表达外源基因；而如本处准确所示，获得多能性分子网络的重编程 iPSC 克隆则不表达 GFP。

该图显示了利用抗体对来自底特律 5 51 成纤维细胞的克隆进行的免疫组织化学分析，所用抗体包括 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-4、T4 和纳米抗体，结果清晰可见。重编程后的诱导性多能细胞（IPCs）表达所有这些标志物。此外，通过定量逆转录聚合酶链反应（R-T-P-C-R）分析基因表达，结果显示与亲代成纤维细胞相比，T4、SOX2、KLF4、M 和纳米基因的表达显著上调，且其表达水平与 H9 胚胎干细胞（HSCs）相当。

观看本视频后，您应充分了解如何感染病毒，并通过荧光显微镜识别和挑选完全脂质编程的 IPA 细胞。