利用四转录因子、多西环素诱导型慢病毒转导系统重编程小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导性多能干细胞

大家好，我是 Brad Hamilton，来自 STEM Gen 的研发部门。今天我们将向您展示一种从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导性多能干细胞的实验方法。

该实验步骤既可用于诱导性多能干细胞的生成，也可用于研究重编程过程。现在我们开始操作。首先将小鼠胚胎成纤维细胞（或称为MEF细胞）接种至直径15厘米的明胶包被培养皿中，接种密度为每皿4 × 10⁵个细胞。

现在加入 30 毫升甲醇生长培养基，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养细胞两天，直至细胞融合度达到约 80%。培养结束后，吸除培养基，加入 30 毫升含有浓缩慢病毒的生长培养基。

轻轻摇晃培养皿，以确保培养基分布均匀。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，完成病毒转导。接下来进行多西环素诱导的重编程。

转导后20至24小时开始重编程，用胰蛋白酶消化转导的细胞，并在200 ×g下离心5分钟。接下来，小心吸除细胞沉淀中的培养基，并将细胞重悬于生长培养基中。待细胞悬浮后，根据所使用的细胞培养皿尺寸，以适当的浓度接种转导的细胞。

在此，我们使用每10厘米培养皿2.5×10⁵个细胞进行重编程效率实验和iPS克隆分离，使用每孔2×10⁴个细胞接种于4孔板中进行免疫化学实验。为监测转导效率，将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。在此阶段，如需后续分析，细胞可冻存于液氮中。

第二天，吸去培养基，更换为添加了多西环素的新鲜生长培养基，使其终浓度为每毫升2微克。设置一个不含多西环素的培养基作为阴性对照。最后将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育。

我们已启动重编程过程。一般来说，多能干细胞克隆在16至22天后将生长至足够大，可用于分离。

在演示该步骤之前，我们需要首先使用化学方法检测转导效率。在多西环素诱导后48小时，对重新接种于四孔板中的细胞进行免疫化学检测。本方案中列出的所有体积应根据细胞培养板的尺寸进行调整，首先轻柔地洗涤细胞。

用不含镁离子和钙离子的 PBS 洗涤一次后，在室温下用 500 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞 15 分钟。随后在室温下用 PBS 轻柔洗涤细胞两次。接着，加入 500 µL 冰冷的含 0.2% Tween 20 的 PBS，室温孵育 10 分钟，以通透细胞。

再洗涤细胞两次后，在室温下加入200微升封闭缓冲液，封闭非特异性抗体结合，孵育1小时。然后加入200微升所需的一抗。

此处我们使用多能性标志物 T 4K LF four、SOX two 和 cmic。第二天将细胞在 4 摄氏度下孵育过夜。用 PBS 轻轻洗涤细胞两次后，避光条件下于室温加入 200 微升二抗孵育一小时。

此处我们使用与荧光染料偶联的适当二抗进行可视化，在孵育后采用倒置荧光显微镜观察。再将细胞洗涤两次，随后加入DPI并再次孵育10分钟以显示细胞核。最后，在最后一次洗涤后，加入抗荧光淬灭封片剂（antifa aqua mount），然后使用倒置荧光显微镜对细胞成像，以确定转导效率。

开始分离和扩增多能干细胞。启动重编程过程后，每天监测培养物，并每48小时更换一次相应的培养基。我们使用添加了多西环素的培养基培养细胞前12天，之后从培养基中去除多西环素。

用于扩增而人工挑选的诱导性多能干细胞（IPS）克隆需在含多西环素的条件下培养。应每天监测独立细胞，观察是否出现表明重编程过程的形态学变化。每次实验情况可能不同，但通常在DS诱导后16至22天，克隆即可达到足够大小，适合进行分离；应在开始分离和胰蛋白酶消化重编程克隆的前一天进行此操作。

通过在24孔板中接种经γ射线照射的mets饲养层细胞，密度为每孔5×10⁴个细胞，制备培养板。将细胞在37°C和5%二氧化碳条件下培养过夜。次日，手动挑选每个IPS克隆，并用胰蛋白酶消化以解离细胞聚集体，将解离后的IPS细胞重悬于小鼠胚胎干细胞培养基中，接种至前述24孔板的各个孔中，在37°C和5%二氧化碳条件下继续培养细胞。

每24小时更换一次培养基。每天观察iPS细胞集落的生长情况和GFP荧光。我们在进行多能性分析前，将培养物孵育了六天，然后分装到四孔板中。

确定24孔板中哪些孔的细胞均匀表达GFP。选择GFP表达良好的孔，进行传代处理，以1:8的比例接种至已预先铺有经γ射线照射的间充质细胞饲养层的4孔板中。这些细胞可用于免疫细胞化学（ICC）分析，以启动多能性分析。用不含镁离子和钙离子的PBS轻柔洗涤细胞两次。

每孔加入 0.5 毫升预冷的含 0.2% 20 的 PBS，冰上孵育细胞 10 分钟。在 PBS 中再洗涤三次后，每孔加入 200 微升封闭缓冲液，室温下封闭非特异性结合位点 1 小时。然后每孔加入 200 微升所需的一抗。

此处，我们使用SSEA、nanog和OCT4在4°C条件下过夜孵育细胞。轻柔洗涤细胞两次后，在避光条件下加入200 µL二抗，室温孵育1小时。我们采用与荧光染料偶联的相应二抗，通过倒置荧光显微镜进行观察；再经过两次洗涤后，加入DPI并孵育细胞10分钟。

最后洗涤一次后，在使用倒置荧光显微镜观察细胞前，加入抗荧光淬灭封片剂（antifa aqua mount）。也可利用市售试剂盒对诱导多能干细胞（IPS）集落进行碱性磷酸酶活性检测。该干细胞基因转导可诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可用于在转导中表达转录因子，从而将胚胎干细胞（MES）重编程为IPS细胞。

在用多西环素处理的细胞中可检测到 T four、SOX two、KLF four 和 seic 的表达，而在未处理的细胞中则几乎无法检测到表达。随着时间推移，形态学变化将逐步进展，形成更大、更类似胚胎干细胞（ES 细胞）的克隆集落，其边界清晰，并呈现三维生长特征。当去除多西环素后，部分类似 ES 细胞的克隆集落会出现明显的细胞形态逆转现象。

然而，许多克隆仍保持其诱导多能干细胞（IPS）形态。挑取并传代这些IPS克隆后，可观察到典型的多能性标志物表达，包括碱性磷酸酶、Nanog、T四和SSEA一。

本实验所用的甲基细胞在内源性 nag 位点表达了 GFP。因此，当细胞重编程至多能性状态时，GFP 的表达可作为重编程成功的一个初步指标。我们刚刚向您展示了如何利用四因子多西环素诱导型抗病毒系统，将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。

进行此操作时，需注意在设计重编程实验时，应考虑多个变量以优化重编程效率。首先，可在初次感染步骤中调整有活性的病毒与细胞的比例，以提高或降低转导效率，从而影响靶细胞群体中整合病毒的数量。其次，调整细胞暴露于docs的时间长短，会影响生成的诱导多能干细胞（IPS）克隆数量。

第三，靶细胞的增殖能力会影响重编程效率，因为处于活跃生长和分裂状态的细胞更易于进行重编程。最后，当针对不同细胞数量或不同规格的组织培养皿修改实验方案时，建议根据培养皿的表面积按比例调整靶细胞的数量。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。