利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

您好，我叫 Brad Hamilton。我是 STEM Gen 公司研发部门的一名科研人员。今天我们将向您展示一种利用慢病毒递送重编程因子来重编程人类成纤维细胞的实验方法。

该方法既可用于生成诱导多能干细胞（IPS细胞），也可用于研究重编程过程。IPS细胞在形态、增殖能力以及分化为机体所有组织类型的能力方面均与胚胎干细胞（ES细胞）相似。与ES细胞相比，人类IPS细胞具有显著优势，因其在不涉及破坏胚胎所带来的伦理问题的前提下，仍具备ES细胞的关键特性。

生成患者特异性的诱导多能干细胞（iPS细胞）可避免异体移植细胞可能引发的免疫排斥反应，从而克服了个性化再生医学治疗中的一个重要障碍。现在我们开始操作。在本实验方案的多个步骤中，需用甲醇处理过的培养基替换正在发育的iPSC或诱导多能干细胞的原有培养基。

制备该培养基需要六天时间，因此请至少在开始实验前一周启动准备工作。首先，在六孔板的每孔中接种。

在2毫升甲基生长培养基中加入2 × 10⁵ cfu甲基饲养细胞的孔板，于37°C及5%二氧化碳条件下过夜培养。次日，更换为人类E-S-I-P-S细胞培养基。

将培养基置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜孵育。收集上清液，并在四天内每24小时更换一次新鲜培养基。通过0.22微米滤器过滤上清液。

向收集的上清液中添加浓度为每毫升15纳克的bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）。最终可获得约16毫升的甲基黄酮素条件培养基，将每天收集的上清液在4°C下分别保存。甲基黄酮素条件培养基可在4°C保存1至2周，或在-20°C保存数月。

现在，您已确保甲基纤维素条件培养基将在需要时准备就绪，接下来我们讨论细胞的准备工作。生成诱导性多能干细胞（iPSC）的首要步骤是利用慢病毒将四种具有干细胞特征的转录因子导入人包皮成纤维细胞或BJ细胞。为准备转导，需将BJ细胞以每六孔板孔1×10⁵个细胞的密度接种，并进行培养。

在当天，将细胞置于2 mL培养基中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜培养。通过向六孔板中加入2 mL用蒸馏水稀释的0.1%明胶，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜孵育，开始制备饲养层培养板。明胶可包被孔板表面，为细胞提供附着基质。

现在BJ细胞已准备好进行慢病毒转导，以制备用于转导的病毒。在两毫升新鲜培养基中添加终浓度为六微克每毫升的聚凝胺（polybrene）和四种慢病毒，每种慢病毒分别表达一种人类转录因子：T4、SO2、Nanog和Lin28，确保每种病毒的感染复数（multiplicity of infection, MOI）相同。

这些慢病毒均包含在人源重编程因子慢病毒套装中。进行转导时，只需将BJ细胞的生长培养基更换为含有病毒的培养基，然后轻轻摇动培养板，使培养基均匀覆盖底部。

同一天在37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜孵育。从液氮中取出一管cf one meth饲养细胞并解冻。移除甲基饲养板中的明胶溶液，此时各孔已包被明胶。

将0.2 × 10⁵个细胞加入2 mL甲基纤维素生长培养基中。在37°C和5%二氧化碳条件下过夜培养。次日，用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化BJ细胞，并在200 × g下离心5分钟。

离心后，吸除上清液，并将细胞重悬于生长培养基中。移除甲醇饲养板中的培养基，每孔加入 2 毫升 BJ 细胞悬液。每孔 BJ 细胞浓度应约为 5 × 10⁴ 个细胞。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜孵育。在甲醇饲养层板上的BJ细胞复苏24小时后，将培养基更换为人类E-S-I-P-S培养基，即胚胎干细胞或诱导性多能干细胞培养基。此后每24小时更换培养基，持续七天。

第7天，将胚胎干细胞培养基更换为2毫升甲醇条件培养基。甲醇饲养层细胞一直提供诱导多能干细胞生长所需的可溶性因子，但现在我们需要添加更多这些因子以维持培养体系的健康状态。

甲醇饲养细胞在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育过夜后，所获得的甲醇条件培养基含有所有由甲醇饲养细胞分泌的可溶性因子。通过显微镜观察，选择一个细胞克隆；该克隆在预先铺有ccf1甲醇饲养细胞的24孔板中呈现为新鲜、致密、圆顶状的小型结构，随后将选定的克隆转入人E-S-I-P-S培养体系中进行培养。

培养基中添加10微摩尔的干细胞分子Y 2 7 6 3 2，该成分为一种依赖性激酶抑制剂。前七天内，每24小时更换一次培养基，但更换时不再补充干细胞分子Y 2 7 6 3 2。

7天后更换为甲醇培养基。继续用该培养基传代培养细胞，直至细胞呈现出典型的人类胚胎干细胞形态。观察具有清晰边缘的小型、致密、圆顶状克隆集落。

克隆应大小均一，且核质比高。此时，您已培养出具有胚胎干细胞（ES细胞）形态的克隆，但它们是否也表达ES细胞特征性的基因？为确定这一点，可对克隆进行染色，检测多能性标志物，如TRA-1-80、TRA-1-60、SSEA-4、SSEA-3、T-4-sox-2、nanog和SSEA-1。首先，用PBS轻柔洗涤细胞3次。

接下来，在室温下用500微升4%多聚甲醛或其他固定剂固定细胞20分钟。20分钟后，用PBS洗涤细胞3次，以去除多余的固定剂。随后，每孔加入500微升封闭缓冲液，在室温下孵育1小时，以阻断非特异性结合。封闭步骤完成后，向每孔加入250微升用封闭缓冲液按1:100稀释的一抗溶液。

将细胞在4°C下与一抗共同孵育过夜，次日进行后续操作。用PBS洗涤细胞3次，以去除未结合的一抗。随后在避光条件下，将细胞与250 µL按1:300比例稀释于封闭缓冲液中的二抗于室温孵育1小时，避免荧光淬灭。

用 PBS 清洗细胞三次，直至第三次清洗。加入终浓度为每毫升 1 微克的 DPI 以染色细胞核。最后，检测你的诱导多能干细胞中基因的表达情况。

在显微镜下观察到人皮肤成纤维细胞在共转导 T4、SOX2、Nanog 和 Lin28 后的形态学结果：转导后第4天即可观察到形态学变化，到第17天时细胞簇变得更加紧密。为了进一步表征分离的诱导多能干细胞（iPS）克隆，我们检测了胚胎干细胞（ES 细胞）中常见的多能性标志物的表达情况。这些克隆表现出强烈的碱性磷酸酶活性。

此外，对iPS细胞集落进行了免疫化学染色（ICC），使用了一系列多能性标志物特异性抗体，包括表面标志物TRA-1-60、SSEA-4和SSEA-3，以及核内标志物Oct4、SOX2和Nanog。分离得到的iPS细胞集落对所有标志物均呈阳性。ICC结果显示，这些iPS细胞表现出正确的多能性标志物表达模式，表明这些iPS细胞与未分化的人胚胎干细胞（ES细胞）非常相似。

我们刚刚向您展示了如何利用干细胞基因的慢病毒载体组，通过重编程人成纤维细胞来生成诱导多能干细胞（iPS细胞）。在进行该实验操作时，需考虑多个重要因素。

首先，在初次转导步骤中，可能需要调整活性病毒与靶细胞的比例，以达到最佳的转导效率。其次，靶细胞的生长条件会产生影响。健康且具有增殖能力的细胞更易于进行重编程。

第三，在针对不同细胞数量调整实验方案时，建议根据培养皿的表面积按比例调整目标细胞数量。最后，可考虑使用ROCK抑制剂（如Y 2 7 6 3 2），因为近期研究表明该抑制剂有助于提高人类阳性克隆的存活率。以上即为全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。