小鼠胚胎干细胞高效分化为运动神经元

本实验的总体目标是将小鼠胚胎干细胞分化为运动神经元。首先，将小鼠胚胎干细胞接种于原代小鼠胚胎成纤维细胞上进行培养，并添加白血病抑制因子。随后，通过加入noggin、BFGF和FGF8促进标准化过程，再通过与视黄酸和smoothened激动剂共孵育以诱导运动神经元特化，之后进行轴突伸长和运动神经元成熟。

最后，利用免疫荧光显微镜观察已分化并表达强GFP荧光的MES细胞。与现有的常规方案相比，该方法能够生成大量运动神经元，从而促进运动神经元疾病的研究。这种将小鼠胚胎干细胞分化为运动神经元的方法效率更高，可为脊髓性肌萎缩症的研究提供重要见解。

该方法也可应用于其他运动神经元疾病，例如肌萎缩侧索硬化症。接种原代胚胎小鼠成纤维细胞时，用八毫升0.1%明胶溶液包被四个100毫米的组织培养皿。室温孵育30分钟后，弃去多余液体。将一管丝裂霉素C在活化的PMEF中稀释后加入40毫升PMEF培养基中，分装至四个培养皿，并培养长达一周时间。

接下来，在37摄氏度水浴中解冻一管MES细胞。用5毫升E ES培养基在15毫升离心管中洗涤细胞。在800转/分钟下离心5分钟。

吸弃上清液，并将 MES 细胞重悬于 20 毫升新鲜添加白血病抑制因子的 ES 培养基中。从 PMEF 培养物中移除 10 毫升培养基，替换为 10 毫升 HBG 三型 ES 细胞悬液。接种后持续观察 MES 细胞的生长情况，从 24 小时时的小克隆逐渐发育为 72 小时时直径约 100 微米的克隆。

每天更换培养基以维持细胞增殖，用于诱导生成中脑样细胞。向运动神经元分化。小鼠胚胎干细胞必须首先从 PMEF 饲养层细胞中分离，然后在诱导当天置于悬浮环境中培养。

每 100 毫米 ES 培养物，准备一个经 0.1% 明胶包被的 T150 培养瓶。室温孵育 30 分钟后，吸除多余明胶，并用 PBS 洗涤三次。随后小心吸除 ES 培养物中的培养基，注意不要使松散贴壁的克隆脱落。然后用 10 毫升 PBS 洗涤一次。

现在，为了将MES细胞与PMEF分离，加入3毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，于37摄氏度孵育3至5分钟。确认干细胞和PMEF已从培养皿上脱落。然后加入15毫升新鲜ES培养基，通过移液吹打使细胞集落分散。

将细胞悬液转移至预先包被明胶的T150培养瓶中，在37摄氏度孵育30分钟，使PFS细胞贴附于明胶化表面。随后收集悬浮的MES细胞至50毫升离心管中，通过离心形成细胞沉淀。将细胞重悬于10毫升神经分化培养基中。

使用血细胞计数板对培养基中的细胞进行计数，然后在分化当天将其接种至100毫米的悬浮培养皿中。第一天，通过显微镜观察确认胚胎干细胞（MES细胞）已形成称为胚胎体的小型悬浮细胞团。由于可能存在残留的PMEF细胞贴壁生长，将胚胎干细胞悬液及培养基转移至15毫升离心管中，随后以500 RPM离心3分钟。

收集拟胚体时，小心吸除培养基，向沉淀的拟胚体中加入10毫升新鲜的神经分化培养基，然后将细胞接种至新的细菌培养皿中，继续分化培养24小时。第二天，轻轻摇晃培养皿，将培养基和拟胚体转移至15毫升离心管中。让拟胚体依靠重力自然沉降，小心吸除上清液，再用10毫升运动神经元分化培养基重悬拟胚体。

将 EBS 在新的细菌培养皿中用 EBS 培养基培养五天以诱导分化。第七天，确认 EBS 的直径约为 150 至 200 微米，并在分化过程中表现出强烈的 GFP 信号。第五天，即在消化 EBS 前两天，将 12 毫米的圆形盖玻片放置于 24 孔板底部。

然后加入 0.5 毫升浓度为 100 微克/毫升的聚-DL-鸟氨酸，在 4 摄氏度下孵育过夜。在组织培养超净台中吸除聚-DL-鸟氨酸，使培养板和盖玻片风干。用双蒸水冲洗培养板孔三次。

让盖玻片在空气中干燥以完成包被。将鼠尾层粘连蛋白新鲜稀释为每毫升含2微克，溶于5毫升冰上预冷的1×PBS中。每孔加入0.5毫升，4摄氏度孵育过夜。

在分化过程中用 PBS 洗涤两次。第7天，将拟胚体（EBS）收集至15毫升离心管中，静置使其自然沉降。用 PBS 洗涤四次后，向 EBS 中轻轻加入1毫升 ACU max，轻柔混匀，在室温下孵育5分钟，然后吸除覆盖在 EBS 上的多余 ACU max。

现在加入三毫升 MND 培养基，使用一毫升微量移液器反复吹打约 20 次以解离 EBS，然后在室温下孵育两分钟，将细胞悬液通过细胞滤帽转移至 12 × 75 毫米试管中。对滤膜上残留的剩余细胞团块和细胞重复此解离步骤，以富集单细胞，最终获得六毫升的单细胞悬液。轻轻混匀单细胞悬液，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞稀释至完全 MND 培养基中，调整细胞密度为每毫升 2 × 10⁵ 个细胞后进行接种。

每孔加入0.5毫升细胞悬液至已制备的24孔板中，孔内含有多聚DL鸟氨酸-层粘连蛋白包被的盖玻片。分化细胞在两天后伸出长长的神经突。在培养中，HBG3是一种胚胎干细胞系，来源于经基因修饰的小鼠，该小鼠在运动神经元特异性启动子HB9调控下表达EGFP，并采用特定的分化方案进行诱导分化。

可以利用MES细胞来诱导生成运动神经元。未分化的MES细胞在成纤维细胞饲养层上方形成圆形克隆集落，且表现出微弱的GFP表达。

这些MES细胞从饲养层中分离，并在低黏附培养皿中培养以形成胚胎小体。分化后的MES细胞在第7天后表现出强烈的GFP荧光。将分化后的EBs解离后接种于包被有多聚DL鸟氨酸和层粘连蛋白的培养板上。

培养两天后，分化细胞从贴壁细胞的细胞体延伸出长长的神经突，可通过免疫荧光染色对MES细胞来源的运动神经元进行表征。这些GFP阳性细胞表达泛神经元标志物神经丝蛋白以及两种运动神经元特异性标志物。Eylid one和胆碱乙酰转移酶DPI对细胞核进行共染。

我们的两步分化方案提供了一种高效地将MES细胞分化为脊髓运动神经元的方法。在观看本视频后，您应能够掌握如何高效地将小鼠胚胎干细胞分化为运动神经元。总之，请记住，高质量的小鼠胚胎干细胞是高效生成运动神经元最关键的参数。