小鼠胚胎干细胞（mES细胞）体外悬滴法分化

干细胞具有分化为体内多种不同类型细胞的显著潜能。它们作为机体的一种修复系统，理论上能够无限分裂，以更新其他细胞。

当干细胞分裂时，每个新细胞都有可能保持为干细胞，或转变为具有更特化功能的其他类型细胞。这一充满前景的科学领域正促使科学家探索基于细胞的体外疾病治疗方法。当允许胚胎干细胞在悬浮培养中聚集时，便会启动其分化过程。

在无小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和白血病抑制因子的情况下，这些细胞聚集体被称为胚状体。悬滴法是一种在体外将干细胞分化为胚状体的有效方法。大家好，我是来自斯坦福大学心血管医学部左翼实验室的 Sha Juan。

今天，我们将向您展示一种利用悬滴法使胚胎干细胞定向分化为拟胚体的实验操作流程。我们通常采用该方法将胚胎干细胞分化为心肌细胞。本实验流程包括以下步骤：制备胚胎干细胞的单细胞悬液、形成悬滴培养物、将悬滴培养物转移至超低吸附培养板，以及将拟胚体接种至明胶包被的培养板上。

好的，让我们开始。该实验步骤的第一步是制备胚胎干细胞的单细胞悬液。由于我们通常将未分化的胚胎干细胞培养在小鼠胚胎成纤维细胞上，因此必须将细胞解离并从成纤维细胞中分离出来。

为此，我们采用标准操作对细胞进行胰蛋白酶消化。胰蛋白酶处理完成后，加入小鼠胚胎干细胞培养基以中和胰蛋白酶活性。随后，将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。

然后用移液器反复吹打管底，使细胞团块分散，直至获得均匀的单细胞悬液，无可见细胞团块。随后以1000转/分钟离心5分钟。离心后吸除上清液，并用10 mL小鼠ES细胞培养基重新悬浮细胞。

将细胞悬液转移至预先用0.1%明胶包被的T75培养瓶中，在37摄氏度、5%CO2条件下孵育1小时。1小时后，成纤维细胞已贴壁，而干细胞仍悬浮于培养基中。用移液器吸出培养基以收集干细胞。

以1000转/分钟的速度离心细胞5分钟，吸去培养基。然后加入10 mL分化培养基，通过反复吹打重悬细胞，直至形成均匀的单细胞悬液。使用血细胞计数板对细胞进行计数。

现在我们已准备好使用悬滴法培养细胞悬液。开始悬滴培养时，用分化培养基将干细胞悬液稀释至每20微升含500个细胞的浓度。接下来，将一个150毫米组织培养皿的皿盖翻转过来。

然后将20微升细胞悬液移取到培养皿盖的内表面。使用多通道移液器，向培养皿中加入10毫升PBS。迅速将培养皿盖翻转，并轻轻放置在培养皿上，以形成悬滴。

将培养板盖盖好后，小心地将培养板转移至培养箱中进行培养。细胞静置培养两天。待培养完成后，我们将进行下一步操作，即将悬滴培养物转移至超低吸附培养板中。

两天后，小心翻转培养板盖子，随后吸出180微升新鲜分化培养基，并将数滴加入至96孔超低吸附培养板中。然后用移液器吸取液滴，逐个转移至96孔板中。将培养板放入培养箱中，静置培养三天。

胚胎体将继续生长成球形。当孵育完成后，我们将准备对胚胎体进行铺板，以促进胚胎体进一步分化。

我们将它们转移至一个48孔明胶包被的培养板中。操作时，我们首先在每孔中加入300微升0.1%明胶进行包被。加入明胶后，将培养板在37摄氏度下孵育过夜。

第二天，吸去48孔板中的明胶。然后每孔加入300微升分化培养基。现在逐个将胚胎体从96孔板转移至已包被明胶的48孔板中。

我们通常在次日更换培养基，之后每隔一天更换一次，以维持细胞生长。我们采用这种方法探索更优的胚胎干细胞分化方案。在心肌细胞实验中，我们已向您展示了如何利用悬滴培养法进行小鼠胚胎干细胞的体外分化。

该方法之所以有效，是因为悬滴的圆形底部有利于胚胎干细胞聚集，从而为胚胎体的形成提供了良好的环境。进行此操作时，需要注意悬滴中聚集的胚胎干细胞数量可通过调整初始细胞悬液中的细胞数量来控制。就是这样。

感谢观看。祝您的实验顺利。