在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元
2013年3月5日
多能性人类干细胞（hPSCs）的神经元分化方案通常耗时较长，且需要较高的细胞培养技术。本文中，我们改进了一种基于小分子的分化方法，将其应用于多孔板体系，从而能够以简单、快速且高效的方式在受控条件下生成人类神经元。
以下实验的总体目标是利用多孔板格式将人多能干细胞（H PSCs）分化为神经元。该过程通过收集并接种H PSCs的单细胞悬液至V型底96孔板中，使其在过夜培养中形成胚状体（EBS）来实现。
接下来，将 EBS 转移至含有分化培养基的 U 型超低吸附培养板中，以诱导神经外胚层形成。随后，将 EBS 接种到包被有 Matrigel 的培养皿中，以促进神经元的向外生长。通过免疫荧光检测，约在第 8 天可获得显示典型神经元标志物存在的结果。
将人类多能干细胞分化为神经元的染色方案通常复杂且繁琐。我们在某种程度上偶然发现了一种由人类多能干细胞制备神经元的非常简单的方法。
从技术角度来看，该方法相较于现有技术的主要优势在于操作简便、快速且成本效益高。同时，本实验步骤将由实验室的 Dr MI Z 进行演示。请按照书面方案中所述配制 EB 形成培养基和分化培养基。
在无饲养层条件下培养人多能干细胞（hPSCs），例如使用在基质胶包被的培养板上制备的甲醇处理条件培养基，或采用化学成分明确的培养体系，在亚融合且处于活跃生长状态的条件下进行培养。使用体视显微镜和无菌塑料移液管尖端，机械去除自发分化的细胞集落。用PBS洗涤剩余的未分化集落，并加入含有1×ROCK抑制剂的Accutase进行消化，获得单细胞悬液。
将单细胞在200 G离心2分钟以形成沉淀，然后重悬于少量拟胚体形成培养基中。使用血细胞计数板确定细胞浓度。向剩余的拟胚体形成培养基中添加额外细胞，使细胞浓度达到每毫升40,000至80,000个细胞。
使用多通道移液器将每孔 100 微升样品转移至 96 孔 V 型底板，使每孔细胞数量达到 4,000 至 8,000 个。将板放入水平转子离心机中，在 400 ×g 条件下离心 1 分钟，使所有细胞沉降至孔底。将细胞转移至培养箱中，在体视显微镜下观察，于次日孵育过夜以形成 EBS。
收集EBS，并转移至含有2毫升分化培养基的小体积3.5厘米细菌培养皿中。通过轻轻旋转培养皿洗涤细胞。向超低吸附培养板的每孔中加入100微升分化培养基。
在体视显微镜下观察底部96孔板。将洗涤皿中的EBS以小体积转移至96个U型孔中。培养EBS四天，以在第四天诱导神经外胚层形成。
用分化培养基洗涤细胞，并将细胞逐个接种至经基质胶包被的多孔板（如12孔板）的孔中。细胞应在各孔内均匀分布，以利于神经元不受干扰地向外生长。在室温下放置约10分钟，使EBS松散地附着于基质胶上。
然后小心将培养板转移至培养箱中。在接下来的四天内，神经元将从接种的EBS呈放射状生长出来。此前我们已证明，与其他许多研究一致，通过将H PSCs在常规传代时重悬并接种至低吸附培养皿中形成聚集体，即可简单地生成EBS。
这通常会导致细胞大小分布较广。另一个问题是，悬浮培养的拟胚体（EBs） tends to 相互聚集，从而导致更大的尺寸异质性。为克服这一问题，曾尝试将单个 H PSCs 接种于低黏附孔板中，但这导致无拟胚体形成且细胞死亡。然而，将细胞存活分子 Y 2 7 6 3 2 与聚乙烯醇（polyvinyl alcohol）联合使用——后者已被证明可促进 HSCs 形成拟胚体——使得单细胞 HESC 悬浮液可在一夜之间形成拟胚体（EBs）。
方便的是，在这种多滴度板格式中，通过在每个孔中接种不同数量的细胞，可严格控制胚胎体（EB）的大小。与传统技术不同，在将EBs转移至超低吸附96孔U型板后，使用一种小分子混合物诱导神经外胚层形成，该混合物包含F-G-F-E-R-K-T-G、TGF beta SMA two和BP SMA one抑制剂，随后可将细胞接种于基质胶（matrigel）上以诱导神经元生成。由约8,000个细胞起始形成的EB具有最佳的神经元分化能力，其特征是从接种的EBs中出现明显的神经元突起。
接种后胚状体中心坏死减少，并高表达B rrn three A和β-tubulin III等感觉神经及泛神经元标志物。总体神经分化效率似乎与原始方法相当，迄今为止该方法已适用于HSCs和HI PSCs。已有三个独立的HPSC细胞系（HES以及HIPS细胞）在多孔板实验流程中成功验证，但不同细胞系之间可能存在差异，其分化效率通常无法完全排除变异性。
该图显示了第4天分离的单个神经外胚层细胞，这些细胞以单细胞形式接种，并以约60%的效率成功分化。在多孔板平台上操作EBS最初需要一些训练，但经过一段时间后，您会发现这相当容易。
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概述
本文介绍了一种使用多孔板格式将人类多能干细胞（hPSCs）分化为神经元的协议。该方法简化了过程，使其快速高效，同时保持对分化的控制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 细胞分化
背景
- 人类多能干细胞（hPSCs）可以分化为各种细胞类型。
- 传统的分化协议通常复杂且耗时。
- 高效产生神经元对神经科学研究至关重要。
- 使用多孔板格式可以简化过程。
研究目的
- 开发一种简化的hPSCs神经元分化协议。
- 以受控方式快速产生神经元。
- 便于研究目的获得神经元培养。
所用方法
- 将hPSCs收集并接种到V底96孔板中。
- 在一夜之间形成胚体（EBs）。
- 将EBs转移到U型超低附着力板中，并加入分化培养基。
- 将EBs接种到涂有matrigel的培养皿上，以促进神经元生长。
主要结果
- 在第八天左右观察到典型的神经元标记物。
- 免疫荧光确认了神经元分化。
- 使用该协议高效产生了神经元。
- 该方法允许在研究中进行高通量应用。
结论
- 改进的协议提供了一种快速高效的方法来从hPSCs产生神经元。
- 使用多孔板格式简化了分化过程。
- 这种方法可以增强神经科学的研究能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, scalable generation of functional neurons from human pluripotent stem cells in a multi-titre plate format, addressing the need for efficient, reproducible neuronal models in early-stage drug discovery. By eliminating multi-step precursor expansion and using a chemically defined, small-molecule-based approach, it reduces technical complexity and supports mid-throughput screening applications. The method provides a de-risked source of human sensory-like neurons for target validation and phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuroectoderm induction and neuronal differentiation pathways using defined small-molecule inhibition of TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK signaling.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing in a 96-well format, reducing time from pluripotent stem cells to functional neurons to eight days.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces neurons expressing pan-neuronal (beta-III tubulin) and sensory (Brn3a) markers, suitable for screening compounds affecting neuronal maturation or function.
- Operational Value: Compatible with multi-titre plate formats, allowing standardized seeding, differentiation, and readout in V-bottom and ultra-low attachment plates for assay reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrated across three independent hPSC lines (HES and hiPSCs), supporting cross-line consistency for disease-relevant modeling.
- Operational Value: Enables scalable production of neurons for downstream functional assays, including electrophysiology or high-content imaging, without requiring specialized differentiation expertise.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through rapid neuronal differentiation and enabling lead identification via compound screening in a format compatible with automated liquid handling and imaging platforms.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by providing a defined system to study neuroectoderm formation and neuronal outgrowth from pluripotent stem cells.
- Screening: Yields adherent neurons from embryoid bodies plated on matrigel, allowing standardized compound exposure and phenotypic readout in multi-well formats.
- Analytics: Enables quantitative assessment via immunofluorescence for neuronal markers (e.g., beta-III tubulin, Brn3a) at day eight, supporting dose-response and hit confirmation.
- Translational Research: Uses human pluripotent stem cells to generate neurons with sensory neuron characteristics, offering translational relevance for peripheral nervous system targets.
- Enterprise Reuse: The multi-titre plate format supports assay standardization across teams and sites, reducing variability in neuronal differentiation for repeated screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in neuronal differentiation efficiency (~60% in optimized conditions) and marker expression reduces ambiguity in target engagement studies.
- Operational Value: Simple, chemically defined medium with small-molecule inhibitors eliminates need for complex growth factor changes or feeder layers.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in target validation by providing rapid access to functional human neurons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroscience targets through reproducible, scalable neuronal model generation.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture training for embryoid body handling and multi-titre plate transfers.
- Depends on access to V-bottom 96-well, U-shaped ultra-low attachment, and matrigel-coated plates for embryoid body formation and neuronal outgrowth.
- Necessitates standardization of small-molecule inhibitor concentrations (TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF/ERK) across batches for consistent neuroectoderm induction.
- Adaptation to other neuronal subtypes may require protocol optimization beyond the sensory neuron-biased output observed.
- Limited to adherent differentiation outcomes; not suited for suspension-based or 3D organoid applications without modification.
