监测软体动物 Aplysia 细胞内钙离子浓度变化及突触效能

细胞内钙离子被认为是多种突触可塑性机制中的重要组成部分。这些假说可以通过同时监测钙离子变化和突触效能改变来验证。本文展示了如何通过将钙成像与细胞内记录相结合来实现这一目标。

我们的实验采用软体动物 Aplysia californica 的神经节进行。该实验体系具有多项优势，例如含有易于识别的大神经元、适合 Aplysia 生活习性的低温环境、较慢的信号传导速度以及便于成像观察等。但我们所演示的通用技术可轻松转移应用于其他系统。大家好，我是 Colin Evans，来自纽约市西奈山医学院 Fishburg 神经科学系与 Freedman 脑研究所 Elizabeth Cropper 实验室。

今天，我们将演示在软体动物Aplysia cahora的口神经节中同时成像细胞内钙离子浓度变化和突触效能的方法。为了检测细胞内钙离子，我们将向突触前神经元注射细胞膜通透型钙离子指示剂染料钙橙（calcium orange）。随后将标本置于显微镜下，用尖锐电极穿刺突触前和突触后神经元。

重复的突触前刺激会导致突触后反应增强，表现为突触后电位（PSP）幅度增大。通过检测钙离子指示剂染料的荧光信号，可使我们观察到突触前细胞内钙离子浓度的同步变化。首先，向一只约150克重的成年动物注射75毫升等渗氯化镁溶液以进行麻醉，然后将麻醉后的动物固定于涂蜡的培养皿中，使用粗镊子和剪刀在其足部做切口，暴露口器团块。

口神经节位于口球腹侧，由两个相连的半神经节组成。它包含数百个神经元，这些神经元与其他神经节中的神经元共同参与动物摄食行为的产生与调控。使用精细剪刀剪断所有弯曲的神经，仔细游离神经节，并将其从动物体内取出。

然后将游离的神经节固定在盛有人工海水的硅胶包被培养皿底部。神经节包裹在一层结缔组织被膜中，需将其去除以暴露单个神经元。使用显微镊子、虹膜剪刀并格外小心地剪除该被膜。

为避免损伤神经元，在成像过程中需用约15个分钟针固定去鞘神经节，因为任何移动都会对成像造成干扰。为制备用于细胞内记录和染料注射的尖锐电极，需使用微电极拉制仪拉制毛细管。我们使用壁薄、含细丝的硼硅酸盐玻璃，其外径为1毫米。

记录电极在充满三摩尔醋酸钾时，其电阻应约为10兆欧，因此我们相应地调整拉制仪以制备D型电极。将拉制好的电极尾部浸入10毫摩尔的钙橙染料溶液中，毛细作用会将染料沿电极内部的玻璃丝吸入尖端，随后用200毫摩尔的氯化钾溶液反向填充电极，以确保良好的电接触。我们使用一种自行构建的Bela装置来改善电极性能，并将记录电极的电阻降低至约5兆欧。

将电极以45度角插入氧化铝悬浮液流中。向悬浮液中加入氯化钠，并连接欧姆表，以监测电极电阻。在磨削过程中，我们将盛有背根神经节的培养皿转移至电生理装置上，通过电极穿刺并验证其特性，定位目标神经元。

为进行钙成像实验，我们首先将充满染料的电极插入神经元胞体，并通过施加30分钟、15纳安的超极化电流脉冲，以电穿孔方式将染料导入细胞。随着钙橙（Calcium Orange）进入细胞，细胞体将呈现微弱的粉红色。随后，我们小心地撤回记录电极，将标本静置至少30分钟，以使染料充分扩散至神经元的细小突起中。

接下来，将装有样本的培养皿转移至荧光显微镜下观察。我们使用的是直立式固定载物台显微镜，配备10倍、数值孔径（NA）0.3的水浸物镜，通过移动物镜而非载物台来实现聚焦，这有利于更方便地安装操纵器。

为记录电极选择合适的滤光块。SI 三滤光块可为钙橙（calcium orange）提供正确的激发和发射滤光片，使用中性密度滤光片和视场光阑调节相机参数和照明强度。光照越强，噪声越低，但可能造成样本漂白。

这款冷却型快照CCD相机能够以每秒约30帧的速度捕获500×300像素的图像，并具有良好的信噪比。应尽可能关闭光源快门，以减少对纤毛神经元的照明。在成像软件中，选择感兴趣区域（R ois）。

这些区域定义了软件将进行荧光强度测量的位置。我们通常对突触前神经元的初级、次级和三级分支进行成像。在 difi 神经元旁边放置一个额外的 ROI，以获得背景值，该值随后从所有其他数据点中扣除。

使用细胞内记录电极作用于突触前和突触后神经元，以诱导并监测突触传递。若使用相机的帧输出触发信号来启动数据采集软件，可确保电生理与成像数据采集之间的同步。另一种实现同步的方法是在相机端口内安装一个LED。

在记录会话开始时，此LED会短暂开启，从而提供一个同步标记。在典型的实验中，您通过注入短暂的电流脉冲来触发突触前神经元的动作电位。在此示例中，我们展示了一连串的峰电位以及相应的钙信号升高，以检验特定假设。

可以通过操控钙信号并确定其对突触传递的影响。例如，可将药物如钙螯合剂 EGTA 通过灌流系统或在突触前注射的方式施加。数据通过将成像软件中的记录导出为文本文件，再导入用于采集电生理数据的软件中进行分析，在本实验中所使用的软件为 Cambridge Electronic Design 公司的 spike two。

我们使用自定义编写的脚本绘制 ROI 的强度值以及膜电位的相应变化，通过减去从背景 ROI 获得的背景信号并使用所示公式计算相对变化，来定量分析钙信号的变化。F 零表示刺激前的荧光强度，F 表示刺激期间的荧光强度。此处展示了我们对鉴定出的神经元 B 21 中钙荧光变化进行成像的实验结果。

我们成像的区域如 A 所示，在 B 中，我们在 B 21 诱导了一次动作电位爆发，这在 B 8 引发了突触后电位以及钙信号的变化。B 2 显示了注射钙螯合剂 EGTA 后的效果：在 B 21 诱发的动作电位不再引起广泛的钙荧光增强，且突触后电位的幅度降低。

综上所述，我们已展示了可用于同时监测细胞内钙离子浓度并评估突触传递效能的技术。与大多数功能性成像技术相比，这些技术所需的设备较为简单，且易于学习、操作快速。