通过神经残端将钙染料载入蛙类神经末梢：蛙类神经肌肉接头中钙瞬变的记录

大家好，我是德米特里·萨米古林（Dimitry Samigullin），我在俄罗斯科学院卡赞生物化学与生物物理学研究所的突触过程生物物理学实验室工作。在我们实验室，我们研究神经肌肉接头中钙信号传导的多种途径。测量突触钙水平最常用的方法之一是光学记录。

本文介绍了通过蛙类神经残端将钙敏感性染料加载至神经末梢的方法，同时提供了检测和分析蛙类神经末梢大规模钙瞬变的实验方案。利用该方法，可研究活性药物在突触活动期间对突触前钙水平的影响。

染料加载溶液的制备。荧光素类钙染料俄勒冈绿 BAPTA 以少量粉末形式提供，每份500微克，溶于500微升溶液中。向该粉末中加入14微升含HEPES的溶液。

涡旋混匀上样溶液，然后离心以充分混合。用铝箔包裹含有上样溶液的离心管，避免光照。将上样溶液于–20摄氏度冰箱中保存。

染料加载程序。从动物体内解剖出皮肤胸肌。将解剖得到的组织固定在银衬底的培养皿中。

用精细的不锈钢针固定组织。向培养皿中加入任氏液。使用剃刀刀片从微量移液管的细端切下一小段，长约2毫米。

准备一块橡皮泥，用于将充液毛细管固定在培养皿上。通过硅胶管和由移液管制成的接头，将充液毛细管与塑料注射器连接。用塑料移液管吸除培养皿中临时盛放的林格氏液。

使用注射器进行干燥处理，以防止填充移液管时吸入溶液。从冷冻箱中取出装载溶液的小瓶，并在避光处室温下解冻。

使用精细镊子和剪刀，在无菌显微镜下直视操作，紧邻肌肉处切断神经，保留约两毫米的神经残端。用塑料泥将填充移液管连同导管和注射器固定在培养皿上。

将其移至神经分支附近。用灌注移液管轻轻抽吸神经残端。从灌注移液管的钝端移除吸管。

用注射器通过填充移液管干燥神经残端。将带有神经残端的填充移液管向上移动。用凡士林将神经残端与外界隔离。

再次用注射器将神经残端在填充移液管中干燥。使用带有长移液管尖端的移液器吸取0.5 μL上样溶液。将含有上样溶液的移液管尖端轻轻插入填充移液管中。

将混合物直接注入神经残端。用凡士林封住灌注移液管的开口端。向培养皿中加入少量溶液。

将制备物置于避光、湿润的环境中，室温孵育5小时。孵育结束后，取出制备物，移除含有上样溶液的灌注毛细管。将制备物放入浴槽中，用任氏液冲洗。

将标本连同浴液在8 °C温度下于冰箱中孵育过夜。准备组织以进行显微镜观察。从浴液中取出标本。

将组织置于银衬室中固定，并轻轻拉伸。用新鲜的任氏液冲洗组织。取吸吮刺激电极。

将刺激-吸吮电极置于记录 chamber 内，使其尖端靠近神经的切断端。将神经吸入电极中。电极的制作方法详见 Khazokoff 的文章，该文章链接位于材料列表中。

将制备室固定在显微镜载物台上。放置温度探针。将进液管与制备室中珀尔帖元件的电源线连接。

将流出管置于准备室中。开启灌流泵。打开温度控制器单元。

将控制器单元的温度设置为达到 20 摄氏度。安装紫外线防护罩。在刺激器上设置延迟持续时间和周期。

将一根导线从吸电极连接到刺激器上，然后打开电源。在低倍物镜下，通过开启刺激来观察肌肉收缩情况。

用低钙高镁的任氏液填充灌流系统，设置灌流速度约为每分钟2毫升。更换物镜至40倍放大倍数。

打开Polychrome V，选择发射波长并设置为连续模式照明。打开快门。在40倍物镜下，通过荧光模式照明确认终端已加载。

找到神经末梢并对其进行聚焦。图中显示了已加载的神经以及充分加载的运动神经末梢。使用Red-Short Neuro CCD相机进行视频采集。

运行 Turbo-SM 软件。选择并更改设置。输入的帧数为 500。

输入实验名称。基础配置为每秒 1000 帧。80 乘以 80。

选择外部触发。输入触发前时间。负十毫秒。

输入重复次数，20。在 Polychrome 软件中，选择外触发照明模式。运行 Clampex 软件。

加载刺激程序。该程序可从喀山联邦大学网站的实验室页面下载。在记录之前，在Turbo-SM软件中采集暗场图像。

在三目立方体上选择光路切换级别，将100%光路导向相机。运行刺激程序。

选择感兴趣区域并检查信号。在神经刺激下，我们记录荧光强度的变化，该变化反映了钙离子进入神经末梢。数据分析。

在 Turbo-SM 软件中，选择文件，然后选择平均文件，再选择文件。

输入平均文件的名称，并进行平均化处理。将平均文件保存为 fit 文件。选择“另存为 fit 文件”。

输入文件名并保存。运行 Image J，然后打开以下工具：分析、工具、ROI 管理器。

在 fit 格式中找到已保存的平均文件。将其拖放到 Image J 中。放大窗口以获得更好的视野。在您认为是背景的区域上选择一个矩形兴趣区域。

将其添加到 ROI 管理器。在 ROI 管理器中，选择“更多”→“多测量”。加载下平均值。

复制数据并导出至 Excel。在 Excel 中使用平均值函数计算用于比率的背景平均值。不关闭 Excel，返回 ImageJ，关闭背景计算窗口且不保存。

使用 ROI 管理器删除矩形背景绘图。打开仪器处理中的数学减法功能。输入从 Excel 计算得到的平均阈值，从图像栈中减去背景值。

在神经末梢周围选择一个矩形兴趣区域。将其添加到 ROI 管理器中。在 ROI 管理器中，选择“更多”、“多测量”、“加载下”、“平均值”。

复制并粘贴到 Excel 窗口中。使用 Excel 软件绘制图表。在信号开始前选择一个平坦区域。

加载图形，包含从静息状态下的初始荧光值到信号起始阶段的详细信息。然后确定用于平均静息荧光值的数据点数量。对这些数值进行平均，进而计算出静息状态下荧光的平均值。

将信号除以静息时的荧光强度，减去1后乘以100%。绘制信号曲线并计算钙瞬变的幅度。

荧光信号的时间参数取决于钙离子染料复合物形成正向和/或逆向反应的速度。钙信号上升时间反映了钙离子进入的动力学过程、其在末梢的扩散以及钙离子与染料的相互作用。

钙瞬变的衰减速率取决于染料的亲和力、钙缓冲速率及其清除速率。通过分析钙瞬变的幅度，可用于研究不同活性物质对参与神经递质释放的钙内流的影响。该负载技术非常适用于细胞质钙变化的成像。

利用荧光指示剂，结合单根神经刺激和节律性突触活动，可通过分析钙瞬变幅度来研究不同物质对参与神经递质释放的钙离子内流的影响。以下是一些需要重点关注的事项。

孵育程序包括两个步骤：室温孵育和冰箱孵育。必须严格控制染料在室温下的孵育时间。

根据神经残端的长度、染料种类以及室温条件，孵育时间可能有所不同。如果孵育时间过长，术前的终末段及靠近神经残端的近端部分可能会过度染色。由于在冰箱中孵育时间较长，染料可沿神经末梢均匀分布。

在切断神经后数分钟内，必须将其放入染料负载溶液中，以使染料进入神经；若间隔时间过长，则会导致负载效果不佳，这可能是由于神经断端已闭合所致。为减少染料的区室化现象，可使用染料的延长形式。防止组织长时间受到荧光照射极为重要，因为这会影响其存活。

我们使用可见光通道的微分干涉差（Nomarski）光学系统来寻找神经末梢。在记录过程中，通过光圈限制照明视野。利用神经的快门标记可缩短加载过程的持续时间。

在这种情况下，可以使用玻璃微旁路。