聚合酶链式反应：基础方案及故障排除与优化策略

本实验的总体目标是演示聚合酶链式反应（PCR）的各个步骤，该技术可用于从少量起始材料中扩增出足量的特定DNA片段。首先，准备好PCR反应所需的各种试剂和材料，然后配制反应体系，包括四种脱氧核糖核苷酸、DNA模板、引物以及DNA聚合酶。接下来设定热循环程序并运行PCR反应。

随后，通过检测结果来判断反应是否成功。最终，聚合酶链式反应应产生特定大小的目标扩增片段。

通常，初次接触该实验方案的研究人员在计算各种可变试剂的用量时会遇到一些困难，有时在移液操作和准确量取体积方面也会出现问题，尤其是含有甘油的聚合酶。实验开始前应准备装满新鲜冰块的冰桶。佩戴手套以避免污染反应体系。

混合物与试剂。将 PCR 组分置于冰上，使其完全解冻。这些组分包括 DNA 模板引物、DNA 聚合酶 10 x 反应缓冲液（含或不含氯化镁）、脱氧核苷酸、无菌水和氯化镁。

如果使用不含氯化镁的缓冲液，则需要添加氯化镁。将一个96孔板放入装有冰的容器中，用作0.2毫升薄壁PCR管的支架。现在在工作台上准备好PCR管和管盖。

一个PCR管架、一支耐乙醇标记笔和一套微量移液器。始终创建试剂表格，详细列出反应混合物，并用定量无菌蒸馏水补足至终体积50 µL。例如，使用5 µL不含镁的缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs，以及优化后的4.0 mM氯化镁。

每种20微摩尔引物取1微升，两纳克每微升模板取0.5微升，聚合酶取0.5微升，仅需加入33微升无菌水。如果10×缓冲液中不含氯化镁，或PCR优化需要时，需添加氯化镁。

使用耐乙醇标记笔在每个PCR管上做好标记。首先加入计算好的无菌水体积，然后加入10×缓冲液和10毫摩尔的dNTPs。本反应中，我们将对氯化镁进行梯度浓度滴定。

由于镁离子浓度不会保持恒定，需向各PCR管中单独加入氯化镁，并用无菌水将体积调至10微升，使每管PCR反应中加入40微升终末主混合液。为完成50微升反应体系并补足氯化镁，继续加入DNA模板和引物。最后，在1.8毫升微量离心管中，每50微升反应体系加入0.5至2.5单位的DNA聚合酶。

准备足够量的预混液，以容纳对照样本以及移液过程中的损耗。将微量移液器调至总体积的一半左右，通过移液操作轻轻混匀。将每份检测样本的预混液加入 PCR 管中。

对于不含模板 DNA 的阴性对照，加入所有试剂，并使用无菌水补足缺失的 DNA 体积。对于阳性对照，则使用一组模板 DNA 和引物，在与实验性 PCR 样本相同的条件下扩增已知片段。PCR 扩增仪可快速加热和冷却反应混合物，从而实现双链 DNA 的热变性、引物与 DNA 模板正链和负链的退火，以及 PCR 产物的延伸。

循环次数根据模板大小和DNA的GC含量按通用公式确定。首先对模板进行初始变性，然后进行25至35轮三步温度循环程序。这些循环的第一步是使DNA模板变性。

然后设置最佳程序，退火温度比引物的表观熔解温度低约五摄氏度，随后进行延伸步骤，使聚合酶结合到DNA模板并合成PCR产物。现在输入循环次数。接下来设置程序。

延长延伸步骤以完成扩增子的合成。最后加入终止步骤，将反应混合物冷却至4°C。如果标准PCR条件未能获得目标扩增子，则需要进行PCR优化以获得更好的结果。

因此，如果反应首次未成功，您需要尝试对反应进行故障排查。首先，您应确保问题并非由人为操作失误造成。例如，加样时出现移液错误，或在某个试管中遗漏添加了某种试剂，都可能导致此类问题。

接下来，您可以尝试调整反应条件中的一些严格性参数，例如改变PCR仪的设置，或者改变镁离子浓度是另一种可选方法。您还可以尝试在试剂中添加一些添加剂，以解决出现的问题。或者，可以考虑采用热启动PCR这一灵活的改进方法，该方法显著延长了初始变性时间。

随后采用AROS凝胶电泳分离酿酒酵母基因组DNA中GAL三基因的PCR产物，以确定该组试剂的最佳镁离子浓度。注意观察是否出现预期大小的PCR产物。在镁浓度为2.5毫摩尔时，开始出现大小为2098个碱基对的PCR产物，最佳浓度为4毫摩尔；而在不同DNA模板上扩增目标PCR产物并形成清晰条带时，需要2毫摩尔的镁离子。降低反应严谨性至亚 optimal 扩增条件会导致出现非特异性产物的弥散条带。

此外，随着反应严谨性的整体提高，形成扩增子所需的镁离子量减少。因此，在优化PCR时注意各种变量，可以获得特异的目标产物。观看本视频后，您应能够充分理解如何设置和准备聚合酶链式反应。

目标是了解每种 PCR 的变量及其如何被调控以产生所需的扩增片段。