基础 Caenorhabditis elegans 实验方法：同步化与观察

在本视频中，我们将向您展示如何将秀丽隐杆线虫同步至一龄阶段。这是一种简单且常用的方法，因此非常实用，尤其适合初学者。

如果您是 C 语言专家，您可能会在此找到一些优化本实验方案的建议。线虫同步化的基本原理在于幼虫和胚胎对碱性次氯酸盐溶液的抵抗力相对强于成虫。将含有大量胚胎的成虫与次氯酸盐溶液共同孵育，可杀死成虫而保留胚胎。

同步化的第二部分通过缺乏食物来实现，这样即使胚胎在不同时间孵化，它们的发育也不会超过L1阶段。启动快速处理方案的第一步是准备处于产卵阶段的线虫，此时平板上应分布有多个卵。使用M9缓冲液收集成虫以进行收获。

此外，可用柔软材料（如一段X射线胶片）刮取已爬到培养皿表面的胚胎，并用若干次M9缓冲液洗涤以去除细菌，通常洗涤数次即可。线虫洗涤完毕后，即可根据我们的偏好加入 freshly prepared bleaching solution（新鲜配制的漂白液）。

在振荡试管的同时控制孵育时间。可在体视显微镜下观察成虫的产生情况。当几乎无尸体残留时，加入M9缓冲液至试管完全充满，以终止反应。

完成实验方案后，至少进行三次洗涤。将M9中的虫卵在M9缓冲液中持续振荡孵育过夜，以使虫卵孵化，但阻止线虫进一步发育。尽管同步化可在15至25摄氏度之间的任意温度下进行，但推荐使用15°C。

由于发育速度较慢，正如我们在其发育过程中所提到的，秀丽隐杆线虫在进入成虫期之前会经历四个幼虫阶段，所需时间取决于培养时的温度。尽管C型秀丽隐杆线虫能够耐受15至25摄氏度的生长温度，但其生长速率更高。

在此较高温度下，可以看到经过24小时后，线虫所处的发育阶段有所不同。在15度和25度条件下，48小时后在25度下已可观察到胚胎。然而，我们需要等待超过80小时才能在培养板表面看到胚胎。

为了获得最佳实验结果，需在15摄氏度下培养线虫，在进行快速处理实验时必须考虑若干因素。同时，识别出适合实验需求的线虫发育阶段也至关重要。接下来，我们将展示如何通过大小、微分干涉相差显微镜观察或染色方法来区分线虫的不同发育阶段。

在此图中，可以看出氮化镓蠕虫的生长速率随温度的变化情况。正如我们所说，在25摄氏度时，其生长速度要快得多。海洋生物的体型与其发育之间存在相关性。利用适当的软件，可以对生物体进行测量，并将其归类到相应的发育阶段。

然而，根据此图，位点是发育阶段的粗略标志。通过观察海洋生物的部分解剖结构，可实现更为一致的分期，这些解剖结构可通过微分干涉、相差显微镜或DPI染色进行观察和识别。在本实验室中，我们已采用该方案对蠕虫进行同步化处理，以用于不同的实验，包括单染色微卵、原位可视化以及up染色。

此外，本方案还能帮助您消除污染。采用微分干涉差或明场显微镜来增强对比度。对于未染色的透明样本，可将动物活体置于2%琼脂糖基质上，琼脂糖溶液可预先配制，并在需要时于4°C保存。

可以将其融化并保持在65摄氏度。琼脂糖融化后，取一些胶带贴在载玻片上，并将它们放置在另一张载玻片的两侧。小心取一些琼脂糖，在无胶带的载玻片上滴加一滴。

用另一张载玻片横向覆盖在琼脂块上。待路径凝固后，小心地将两张载玻片相互滑动分离。垫层将附着于其中一张载玻片上。

在垫上添加一些亚马逊试剂以保持线虫固定。在解剖显微镜下挑选一些线虫，并将其转移至 lele 液滴中。注意避免损伤路径。

取一张盖玻片，在其边缘处添加一些指甲油。小心地将盖玻片放置在载玻片上，防止产生气泡。制备完成后可立即在显微镜下观察。秀丽隐杆线虫（C. elegans）解剖结构中最容易观察的特征之一是咽部（Alva）。

例如，具有圣诞树形状的 aava 是 L4 期的特征。通过发育过程获得的 c elgan 解剖学详细信息可从 www.orla.org 获取。Tapis 染色是用于鉴定单个细胞的常用方法。

使用压片法固定是固定线虫的快速方法。进行DAPI染色时，首先在显微镜载玻片表面加入一滴M9缓冲液。直接从培养板上挑取一些线虫，并将其转移至M9缓冲液液滴中。

用移液管或柔软的纸巾除去多余的 M9 液体。向线虫中加入一滴液体。重复此步骤。

第一滴干燥后，加入含有API的封片剂，盖上盖玻片，然后将样本置于显微镜下观察。在带有API的温热支架中，可轻松观察到该过程的发展。