冷冻电子断层扫描数据采集优化策略

大规模数据采集会话的设置是一个耗时的过程，可能会显著减少可用于倾转系列采集的剩余显微镜时间。本方法可实现大规模自动化断层扫描数据采集的快速设置，从而最大限度地提高需要仔细选择采集目标的断层扫描实验的时间效率。首先打开一个虚拟的 SerialEM 实例。

完成第一个网格区域的成像后，使用 SerialEM 导航器菜单中的合并功能，在虚拟的 SerialEM 实例中查看拼接图像。双击导航器窗口以打开网格区域地图。在地图中查找目标区域，并使用虚拟 SerialEM 导航器的“添加点”功能，在感兴趣的目标区域上添加图像采集点。

完成新方格的映射后，保存导航器文件并再次合并导航器。重复此过程，直到所有网格方格均被映射。随后，再次将导航器文件与虚拟的 SerialEM 实例合并。

从虚拟 SerialEM 菜单运行 Pi EM 虚拟图谱脚本。选择工具，然后选择虚拟锚定图谱。根据网格方块图谱的大小和数量，以及视图和预览图谱的 binning 设置，此过程可能需要一些时间。

为确保显微镜性能正常，需按以下顺序进行数据采集时使用相同的放大倍数和束斑尺寸设置。通过CTF运行SerialEM的无像散对中程序。插入并居中物镜光阑。

在 SerialEM 中通过 CTF 和 GIF 快速调谐校正像散。在 SerialEM 中打开新的导航器文件，取消选择所有 A 点。

选择第一个视图地图。选择折叠。点击 A 两次，然后取消选择折叠。

选择第一个视图图谱位置。按下 Shift+T，然后选择最后一个视图图谱位置，再次按下 Shift+T。在文件属性中选择单帧图像以打开对话框。

在下一个文件属性对话框中，根据成像需求和仪器设置选择所需的参数。出现提示时，输入带编号的名称，然后点击保存。为第一个倾斜系列（TS）位置设置倾斜系列控制器。

完成后，单击“确定”以将这些参数设置应用于此采集项目之后的所有倾斜系列。所有预览图现在均已选为倾斜系列（TS），并分配了编号的文件名。如有需要，为每个目标设置聚焦/追踪距离。

双击视图地图以加载。在导航器列表中选择预览地图，然后在导航器窗口中选择编辑焦点。

在低剂量控制面板中，取消选择“旋转区域间轴”以沿样品台倾斜轴对齐和定位试拍及聚焦。在加载的视图图谱中单击所需区域，以设置该倾斜序列的聚焦试拍位置，并确保导航器项目已设置为 TSP。对所有项目重复此操作。

在每次倾斜系列开始前运行的 PreTomo 脚本中编辑焦距范围。在 SerialEM 倾斜系列菜单中，勾选“在倾斜系列中运行脚本”并选择 DuringTomo 脚本的脚本编号。检查氮气罐液位，并确认是否已选择自动装载器涡轮关闭功能。

检查数据存储的可用空间。在 SerialEM 的文件菜单中，取消勾选日志文件的连续保存选项。每个倾斜系列将拥有其独立的日志文件。

在导航菜单中点击“acquire”项目后，运行 PreTomo 脚本。选择主任务“acquire tilt series”，然后选择在 PostTomo 后运行脚本。勾选“结束时关闭柱阀”和“结束时发送邮件”，然后点击“go”。

在低倍率下，从网格图中选取了71个合适的方格。使用能够直接可视化并识别目标样本（本例中为冠状病毒）的设置，获取中倍率图。每个方格的采集时间为3分钟，总计3小时45分钟。

创建第一张方格图后，在另一台计算机上打开了一个虚拟的SerialEM实例，用于可视化方格图，并在适合进行倾转系列采集的靶标区域添加点。设置SerialEM的低剂量模式，获取并保存参考图像和预览图像作为地图。随后，这些地图可立即在虚拟SerialEM实例中使用，以从相应的方格图图像生成虚拟视图和虚拟预览。

利用虚拟视图图谱对目标进行初步居中，随后使用虚拟预览图谱在实际倾转系列采集的放大倍数下进行最终居中。用户应预留充足时间充分探索样品的形貌特征。在搜索若干图谱后，使用者将更能准确判断适合数据采集的高质量区域。