从小鼠肠道中分离与鉴定树突状细胞和巨噬细胞
2012年5月21日
本文详细介绍了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法。通过多色流式细胞术对肠道树突状细胞和巨噬细胞进行表型鉴定，同时采用磁珠富集联合细胞分选技术，获得高纯度的细胞群体用于功能研究。
本实验的总体目标是快速分离小鼠肠道树突状细胞（dcs）和巨噬细胞，用于表型和功能特征分析。首先获取肠道组织，然后通过第二步将肠上皮与固有层分离。
接下来，在实验的最后步骤中消化肠道固有层。使用荧光标记的偶联抗体对固有层细胞进行染色，并圈定特定的细胞群体。最终，可更准确地鉴定和纯化肠道树突状细胞（DC）和巨噬细胞群体，用于功能研究，以评估细胞因子产生、抗原提呈以及免疫细胞的调控作用。
因此，与现有方法相比，该技术的主要优势在于组织消化速度快，可确保细胞表面抗原表达最佳，同时保持细胞活性及完整性。在处死小鼠并通过脚趾夹捏反射确认死亡后，用70%乙醇喷雾测试小鼠腹部和胸部。然后使用剪刀在腹部中央做一个小的横向切口，并将皮肤向后剥离以暴露腹膜。
使用剪刀在幽门括约肌处切开，分离胃与上段小肠，并用镊子剥离肠系膜，从而打开腹膜。在回盲瓣处再次剪开，使整个小肠与大肠分离。继续分离大肠上的肠系膜，并在肛缘处做一切口。
使用剪刀纵向剪开结肠，并用室温的 C-M-F-P-B-S 冲洗肠腔内的粪便内容物和黏液。然后使用剪刀和镊子在肉眼观察下沿小肠对系膜缘分离出派尔集合淋巴结，并将小肠纵向剪开。
接下来，用更多室温的 C-M-F-P-B-S 冲洗小肠腔，清除粪便内容物和黏液。 separately，将小肠和大肠剪成约 1.5 厘米长的片段，并放入各自含有 30 毫升预热的添加了 FBS 和 2 毫摩尔 EDTA 的 C-M-F-H-B-S-S 的 50 毫升锥形管中。将每个 50 毫升锥形管水平放置于摇床上，在 37 摄氏度下以 250 转/分钟的速度振荡 20 分钟。
接下来，将单层金属网筛置于废液桶上方。将每个50毫升锥形管中的内容物倒入网筛中，以回收肠段组织，随后将其转移至新的单独含有30毫升添加胎牛血清（FBS）和2毫摩尔EDTA的预温C-M-F-H-B-S-S溶液的50毫升锥形管中。最后，将这些锥形管重新放回轨道摇床中，继续孵育20分钟。
第二次振荡后，将每根试管中的内容物通过滤网倒入。再次用纸巾吸去多余的培养基，然后将肠段转移至小型塑料滤网舟中。该技术中最关键的步骤是组织消化，为确保成功，必须快速使用剪刀，并综合考虑消化时间、胶原酶的特性、组织完整性以及待消化组织的大小等各种不同参数。
将肠段切碎，然后将剪碎的肠组织加入含有20毫升胶原酶溶液的50毫升锥形管中。将锥形管水平放置于摇床中，在37摄氏度下以200转/分钟振荡消化10至20分钟。随后短暂涡旋振荡管子，以确保残留的肠组织充分解离，接着将细胞悬液通过100微米细胞滤网直接过滤至另一个50毫升锥形管中。
最后，用含FBS的C-M-F-H-B-S-S补满锥形管，将细胞悬液在4°C条件下以425 × g离心5分钟，重复两次。随后弃去上清液，用预冷的含FBS的C-M-F-H-B-S-S重悬细胞沉淀，并将样品置于冰上。接着对细胞进行目标表面蛋白的染色。
首先创建一个点图，排除此处所示的死细胞染料阳性的细胞。接着，如图所示排除双联体事件。然后利用前向散射和侧向散射通道对目标细胞进行圈选，注意排除碎片。
然后创建另一个点图，圈选 CD45 阳性和 IAB 阳性抗原。在单独的点图中展示细胞，并创建区域以区分特定的树突状细胞（DC）和巨噬细胞亚群。此处显示的 R1 区域圈选的是 CD11c 阳性、CD11b 低表达阴性细胞。
R2区域划定的细胞与R1区域细胞具有相似水平的CD11c表面表达，同时表达CD11b。R3区域指代CD11b阳性、CD11c弱阴性的细胞。这三个区域可进一步分析F4/80和CD103的表达，以分别区分巨噬细胞和树突状细胞（DC）群体。如本点图所示，R1区域中CD11c阳性、CD11b弱阴性的细胞将高表达αE整合素CD103，而F4/80表达水平较低。
该点图显示，根据 CD103 和 F480 的双相表达情况，R2 区域中 CD11b 阳性 CD11c 阳性细胞将由树突状细胞（DCs）和巨噬细胞共同组成。最后，根据其 F480 阳性且 CD103 阴性的表型特征（R3），经圈选的 CD11b 阳性 CD11cδ 阴性细胞将主要为巨噬细胞。以下六幅图展示了组织消化时间长短对总细胞得率以及 CD11b 和 CD11c 表达水平的影响。消化 3 分钟的肠道组织获得的总细胞数量较低，导致可用于表征的树突状细胞和巨噬细胞较少；而消化 11 分钟则可获得较高数量的活细胞，得到的树突状细胞和巨噬细胞群体表现出较高水平的 CD11b 和 CD11c 表达，且具有明确的表型特征。
相比之下，消化50分钟所获得的细胞数量与优化消化条件下的结果相似，但使用CD11B和CD11C对不同细胞群体进行区分变得更加困难，因为CD11C的表达减弱，且死细胞数量增加。
因此，在优化肠道组织消化参数后，可快速获得较高的细胞得率。快速分离小鼠肠道树突状细胞和巨噬细胞，有助于评估具有完整表面抗原的免疫细胞的功能特性。
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概述
本文详细介绍了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法。该步骤包括获取肠道组织、分离肠上皮以及消化固有层，以实现对这些免疫细胞的准确表征与纯化。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 神经科学
背景
- 肠道树突状细胞和巨噬细胞在免疫应答中发挥关键作用。
- 准确的分离对于功能研究至关重要。
- 多色流式细胞术用于表型鉴定。
- 磁珠富集可提高细胞纯度。
研究目的
- 快速分离小鼠肠道树突状细胞和巨噬细胞。
- 对这些细胞进行表型和功能表征。
- 评估细胞因子产生和抗原提呈能力。
使用的方法
- 从小鼠中采集肠道组织。
- 将肠上皮与固有层分离。
- 消化固有层以获得细胞群体。
- 使用荧光标记抗体对细胞进行染色，用于流式细胞术。
主要结果
- 成功分离出高纯度的肠道树突状细胞和巨噬细胞群体。
- 利用流式细胞术进行准确的表型鉴定。
- 增强对这些免疫细胞功能特性的研究能力。
- 深入了解细胞因子产生及免疫调节机制。
结论
- 该方法可快速高效地分离免疫细胞。
- 有助于深入研究肠道免疫应答的功能。
- 有助于理解树突状细胞和巨噬细胞在肠道免疫中的作用。
常见问题
行业高管相关性
快速分离具有活性的肠道树突状细胞和巨噬细胞，可实现对肠道免疫细胞群体的准确表型和功能特征分析。该方法通过保持细胞表面抗原表达和细胞活性，支持以免疫学为重点的发现项目中的靶点验证和作用机制去风险化。该技术为在疾病相关背景下评估免疫调节化合物提供了一个可重复的实验体系。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可用于研究树突状细胞和巨噬细胞亚群在肠道耐受性及炎症通路中的作用。
- 操作价值：可获得高纯度的细胞群体，用于功能检测，评估细胞因子产生和抗原呈递能力。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成树突状细胞和巨噬细胞活化状态的定量流式细胞术检测结果。
- 操作价值：通过磁珠富集和多色染色方案支持检测方法的标准化。
转化与临床前研究
- 科学价值：利用生理相关性免疫细胞促进靶向肠道免疫调节剂的临床前评价。
- 操作价值：通过标准化的分离与表征实现从发现到临床前工作流程的连续性。
流程与工作流整合
该方法通过提供可靠的肠道免疫细胞来源，用于假设验证和通路解析，从而整合到发现生物学的工作流程中。
- 发现生物学：支持对参与黏膜免疫和免疫调节的靶点进行功能验证。
- 筛选：提供可重复、高产量的细胞制备，用于化合物筛选和表型分析。
- 分析：通过流式细胞术实现对细胞表面标志物和功能输出的定量检测。
- 转化研究：通过一致的免疫细胞制备，连接早期发现与临床前研究。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，支持跨治疗领域的肠道免疫学项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过维持细胞表面抗原的天然表达及细胞活性，提高预测的可信度。
- 操作价值：通过快速、标准化的组织消化与分离步骤，降低实验变异性。
- 战略价值：在相关组织环境中实现对免疫调节效应的早期评估，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：支持针对肠道免疫通路的候选分子进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备组织解剖、酶消化和流式细胞术方面的专业知识。
- 依赖于轨道摇床、细胞筛和磁性分离设备的可用性。
- 需要在不同实验室之间对消化时间和胶原酶活性进行标准化。
- 在应用于不同小鼠品系或肠道区域时需考虑适应性调整。
- 受限于对新鲜组织的依赖以及必须立即处理以维持细胞完整性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Dissection and Dissociation of Intestinal Epithelial Cells
3:56
Tissue Digestion and Isolation of Intestinal Cells
5:47
Gating Strategy for Laimna Propria Antigen-presenting Cells
7:55
Results: Cell Yield and Antibody Staining Quality Depends on Digestion Time
8:58
Conclusion
