从受肥胖相关炎症影响的组织中分离、表征与纯化巨噬细胞

本实验的总体目标是从饮食诱导炎症常累及的组织（如肝脏）中有效分离并鉴定巨噬细胞。该方法有助于解答免疫学与炎症研究领域中的关键问题，即组织驻留型巨噬细胞表型如何决定慢性炎症性疾病的进展过程。该方法的主要优势在于优化了从肥胖介导的低度慢性炎症所累及组织中获取单细胞悬液所需的分离步骤。

进行该操作演示的是我实验室的研究生 Joselyn Allen。分离肝脏时，首先将经乙醇浸泡的小鼠仰卧固定于聚苯乙烯泡沫解剖板上，并固定其前肢和后肢。接着，用中号尖头镊子夹住尿道口附近的腹部皮肤，用锋利的解剖剪在提起的皮肤上剪开一个小切口。

将剪刀的下刃插入皮肤与腹膜之间的切口，从腹股沟向下巴方向做一侧向切口。轻轻向后牵拉皮肤，暴露完整的腹膜腔和胸壁，并通过腹膜做一侧向切口。抬起胸骨，小心切开膈肌。

然后将胃肠道器官移至一侧，找到肝下腔静脉（IVC）。使用止血钳夹闭肝上腔静脉，以维持局部灌注，并将装有预热灌注缓冲液的注射器连接到23号血液采集和输注装置上。轻轻推动活塞，直至灌注缓冲液充满管路和针头，然后将针头平行插入肝下腔静脉。

正确插管下腔静脉可确保解离缓冲液在肝脏及外周组织中均匀分布，从而优化组织消化效果。使用4 cm止血钳固定针头位置，并轻压注射器推杆以开始灌注。若针头位置正确，肝脏颜色将迅速变浅，肝叶随之肿大。

迅速剪开门静脉，使灌注缓冲液能够自由流经肝脏，期间可偶尔用拇指和食指轻轻按摩肝叶，以促进血液排出。当灌注缓冲液仅剩5毫升时，将灌注缓冲液注射器更换为装有预热解离缓冲液的注射器，继续轻柔按摩肝叶并灌注肝脏，直至肝脏完全消化。通过用镊子的钝端轻轻按压左侧肝叶来确认消化是否成功。

移除镊子后，表面应出现一个压痕，并随着镊子的移除缓慢充盈。随后移除针头，使用解剖剪的一片短直刀片小心切断连接韧带，以完整切除肝脏和胆囊。将肝脏转移至一个含有10毫升冰冻DMEM的10厘米培养皿中，并用有齿镊夹住已切断的肝上腔静脉（IVC）。

使用中号镊子，对每个肝叶进行快速划动，以使细胞从格利森囊中释放，并将饱和的DMEM通过置于冰上的50毫升锥形管中的70微米细胞筛网。只有将肝细胞从格利森囊中充分解离，才能获得高产量的活细胞。当所有细胞收集完毕后，倒置试管轻轻混匀细胞悬液，并通过离心沉淀细胞。

将上清液转移至新的50毫升锥形管中，再进行三次低速离心。最后一次离心后，将上清液转移至新的50毫升离心管中，再以较高速度对细胞进行一次离心。随后，用FACS缓冲液重悬非实质细胞沉淀，进行细胞计数，并根据后续实验应用，将肝细胞稀释至适当浓度，置于标记的5毫升圆底聚苯乙烯管中。

食用高脂饮食或高脂高胆固醇饮食的小鼠，其主动脉等受影响组织中经典活化的M1型巨噬细胞浸润增加。在食用高脂高胆固醇饮食的小鼠中，表达RON受体的主动脉CD45阳性F4/80阳性巨噬细胞（具有抗炎表型）数量减少，而促炎性的CD45阳性F4/80阳性CD11c阳性巨噬细胞在这些动物分离的主动脉中数量增加。此外，从消化后的主动脉中分选得到的表达RON受体的巨噬细胞显示出Arginase 1基因表达升高，该基因是公认的M2型巨噬细胞标志物。

事实上，对肝脏驻留巨噬细胞的表征显示，表达 RON 受体的亚群占主导地位，而 CD11c 阳性的促炎性巨噬细胞群体则表现出与抗炎 M2 表型密切相关的基因表达水平下降。在消化白色脂肪组织后分离得到的巨噬细胞群体中也观察到类似趋势，具有促炎表型的巨噬细胞群体表现出 RON 受体表面表达降低。若操作熟练，每只动物的实验可在 20 至 30 分钟内完成。

完成此操作后，可进一步采用流式细胞术、荧光激活细胞分选和/或定量 PCR 等方法，以更深入地表征分离所得肝脏来源的组织驻留巨噬细胞的表型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从病变肝脏中正确分离组织驻留巨噬细胞。感谢观看，祝您的实验顺利成功。