用于表征蝗虫（Schistocerca americana）嗅觉回路中神经活动的多单元记录方法

本实验的总体目标是记录昆虫嗅觉通路前三个信号处理中心中由气味诱发的多单位神经电活动。首先，将一只蝗虫固定在定制设计的记录室中，并稳定其一根触角以进行电生理记录。第二步是制备玻璃微电极，并将其插入触角梗基部，以监测气味诱发的神经反应。

接下来记录蝗虫大脑的神经活动。通过多步骤的解剖程序暴露神经组织，该组织负责处理来自嗅觉感觉神经元的输入信息。最后一步是将多电极阵列适当地放置在蝗虫的触角叶和蘑菇体，以记录其群体神经活动。

最终，本文所展示的细胞外记录方法可用于表征昆虫嗅觉通路中前三个信息处理中枢对气味刺激产生的反应。尽管该方法已被用于研究相对简单的无脊椎动物嗅觉系统中由气味诱发的神经反应，但也可加以改进，用于检测其他神经系统的群体神经活动。该方法的可视化演示至关重要，因为该实验流程中的某些关键环节，例如电极放置和部分解剖步骤，极难通过文字描述掌握。

此外，这些方法大多是定性的，不同实验室在长期实践中已发展出各自优化的方案。开始本实验时，从高密度群体中选取一只性成熟前、具有完整翅膀的年轻成年蝗虫，性别不限。接下来，通过截除其腿部来固定蝗虫。

使用组织粘合剂封闭截肢部位。然后用一小段电工胶带缠绕蝗虫胸部，将其固定在定制设计的实验腔室内。在解剖显微镜下，于蜡制平台表面刻出浅槽，用于放置触角。

将天线放入槽中，并用蜂蜡在天线两端固定以保持稳定。随后，将一根接地电极插入胸部。使用蜂蜡封闭切口部位，并固定接地导线。

接下来，将稳定的蝗虫触角置于防震台上的体视显微镜下。将气味瓶的出口管路连接至气味递送管。将气味递送管放置在距离触角几厘米处，同时在蝗虫触角后方约10厘米处放置一个真空抽滤漏斗，用于清除已递送的气味蒸气。

然后，使用硼硅酸盐玻璃毛细管在微电极拉制仪上制备玻璃电极，并用蝗虫生理盐水填充玻璃电极。接着，将玻璃电极放入固定在电动显微操作器上的微电极夹持器中。确保在显微镜下能够清晰地看到记录突触的基部。

将电极轻轻插入突触的底部，随后使用交流放大器将信号放大10,000倍。

将信号在0.3至10.0千赫兹范围内进行滤波，并以15千赫兹的采样率进行采集。使用数据采集系统，当电极位置适当时，可检测到自发性神经活动。通过气味递送管传递气味脉冲，可监测刺激诱发的反应。

将电极置于靠近触角的位置，记录细胞外活动的变化，并按照先前所述的固定步骤进行操作。将蝗虫放置于定制设计的记录室中。开始解剖前，先在蝗虫头部周围用石蜡制作一个蜡杯。

在蝗虫头部两侧各构建一个蜡塔，使其高度达到触角的位置。接着，将每根触角插入一段紧密贴合在橡胶垫圈内的小段聚乙烯管中。然后将垫圈固定到蜡塔上，使塑料管能够自由地朝向或远离触角基部滑动，同时防止触角移动。

然后在显微镜下开始在蝗虫头部周围构建一个石蜡杯，以便在解剖过程中及解剖后进行生理盐水灌注。石蜡杯应从口器上方开始，包围两个石蜡柱，并延伸至复眼之外。石蜡杯完全构建完成后，使用环氧树脂将一根触角的基部固定在塑料管的底端。

这将确保即使在去除周围角质层后，触角仍能保持固定。从此刻开始，保持石蜡杯内充满生理盐水。现在，去除两个区域之间的中央矩形部分。

一个触角。随后，在不干扰复眼或触角基部角质层的情况下，去除邻近区域的角质层。使用精细镊子，轻轻移除包围大脑的气囊和脂肪体。

此时应能清晰看到蝗虫的大脑。处理嗅觉信息的脑区位于两侧之间。用镊子轻轻牵拉触角以牵出消化道，并用精细剪刀将其剪断。

然后去除翅膀，并在直肠上方的腹部做一小切口。用粗镊子牵拉后肠以移除肠道。此步骤可确保肠道运动不会影响制备物的稳定性。

为防止盐水泄漏，用缝合线在切口部位前方结扎腹部。接着，使用由细金属丝环制成并涂有薄层石蜡的小型平台，将脑组织抬高并固定，以便进行电生理实验。

大脑被一层半透明的鞘膜保护，记录前必须将其去除。为削弱鞘膜，先将石蜡槽中的液体部分吸出，然后小心地在脑表面涂抹少量蛋白酶。酶作用约5至10秒后，用生理盐水彻底冲洗大脑。

然后用超细镊子非常轻柔地夹住并向上拉动鞘膜，使其撕裂，暴露记录位点。在此操作过程中，将蝗虫标本置于立体显微镜下，并放置在隔振台上。维持约每小时40毫升的恒定生理盐水灌流速度。

在整个实验过程中，使用浸入盛有生理盐水的石蜡杯中的氯化银丝作为接地电极。准备气味递送装置，其设置与单传感器记录实验类似。实验前，对电极进行镀金处理，使阻抗达到200至300千欧范围。

使用16通道硅探针记录主神经元。在显微镜下，将电极置于触角叶表面附近，利用手动显微操作器轻柔地插入组织。在理想的记录位置，多个记录通道将接收到细胞外信号，并具有较高的信噪比。

对于肯尼翁细胞记录，使用自制的绞合金属丝电极，并按照电镀流程对电极进行电镀处理。随后将硅探针上的电极放置在蘑菇体表面。由于肯尼翁细胞的胞体局限于该区域的浅表层，因此可在同一只蝗虫标本上同时记录主神经元和肯尼翁细胞的电活动。

确定记录位置后，至少等待15分钟，以使电极稳定。然后以15千赫兹采集细胞外信号，将其过滤在0.3至6千赫兹之间，并使用16通道交流放大器对自发和刺激诱发的信号进行放大。

可以观察到触角叶中投射神经元的多单元神经活动。原始的细胞外电压迹线显示了嗅觉感受神经元对两种不同气味的反应。此处展示了两种辛醇和一种乙醇。

此处展示了一条来自多单元天线叶记录的代表性细胞外信号轨迹。在此电压轨迹中，可以观察到来自不同主神经元、具有不同振幅的动作电位或尖峰信号。请注意，灰色框所示时间段内施加了持续四秒的气味脉冲。

此处展示了一个蘑菇体细胞外记录的示例。与嗅觉感受神经元和主神经元不同，昆虫蘑菇体中的肯扬细胞具有较低的基础放电活动，并以稀疏且选择性的方式对气味产生反应。为了从这些多单元记录中分离出单个神经元的反应，我们采用已发表的软件在离线状态下进行 spike 分选处理。

此处展示了主神经元和肯扬细胞的 spike 分类示例。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何进行细胞外多单元记录，以表征昆虫嗅觉通路中前三个嗅觉中枢的神经元群活动。