采用“安全捕获”法固相合成功能化双肽

以下实验的总体目标是利用固相技术合成一种功能化的BSP肽。该目标通过将带有保护基的BIS氨基酸加载到羟乙基苯甲酸树脂上实现。随后重复进行深度保护的偶联循环，以连接功能化BIS氨基酸，该过程可延长BIS肽链并呈现所需的功能特性。

最后，通过α-氨基酸对第一个双氨基酸进行修饰，以通过双酮哌嗪的形成将BIS肽从树脂上裂解下来。实验结果表明，功能化的BSP肽已成功合成，粗品纯度良好，分离产率稳定，约为10%（基于液相色谱-质谱分析）。该技术的应用前景包括双肽的平行合成与文库构建，因为BIS肽是在固相树脂上组装的，相比溶液中的反应更易于操作，且副产物可通过过滤轻松去除。

该方法的可视化演示至关重要，因为许多步骤难以掌握，需要大量关键细节来确保所有反应尽可能接近完全。在固相合成中，无法对中间产物进行纯化，因此为了获得纯净的最终产物，每一步反应都必须尽可能进行彻底。

我们建议创建一份实验操作清单，以避免因步骤重复而产生混淆。本方案首先加载第一个 BSP 肽，随后保护第一个 BSP 肽并同时对树脂进行封端。开始时，称取 114 毫克 H-M-B-A-A 树脂放入一个 8 毫升反应容器中，并加入一个磁力搅拌子，以加载第一个 BSP 肽。

用橡胶隔垫封住容器顶部，并用氩气吹扫管内至少五分钟。在此期间，按照书面实验方案中的描述制备活化的 BIS 氨基酸溶液。随本视频操作，用注射器将溶液转移至反应容器中，并在氩气氛围下搅拌过夜。次日，取下隔垫并排出反应混合物。

向树脂中加入约两毫升氯甲烷，洗涤树脂。搅拌30秒至1分钟，然后排干。用二氯甲烷重复此过程四次，再用二甲基甲酰胺洗涤树脂五次。

为了对第一个双氨基氨基酸进行深度保护并同时缓慢封闭树脂，向反应容器中缓慢加入2 mL含33%溴化氢的乙酸和二氯甲烷溶液。排干后用二氯甲烷洗涤树脂五次，随后继续搅拌15分钟。再重复一次D保护步骤。

接下来，用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂5次，随后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤5次；再用体积分数为5%的N,N-二异丙基乙胺（D-I-P-E-A）的DMF溶液洗涤树脂2次以中和树脂。然后再次用DCM洗涤5次，再用DMF洗涤5次。此时可进行保护的功能化双氨基酸的偶联反应。

首先，通过用无水二氯甲烷（DCM）洗涤三次，向含有树脂的反应容器中重新引入惰性气氛。然后安装橡胶隔膜，连接氩气管线，加入一至二毫升无水 DCM 进行冲洗并搅拌 30 秒。随后排空容器，直至氩气管线的鼓泡器开始上升。

至少重复此过程一次。接下来，在氩气氛围下，于火焰干燥的试管中制备功能化双氨基酸溶液。加入 47 µL 的 DIC，并搅拌 90 分钟。

然后将35 µL的D-I-P-E-A加入666 µL无水DMF中，混匀后加入树脂，再搅拌5分钟。通过注射器将预先活化的BIS氨基酸溶液转移至反应容器中，次日继续搅拌过夜。反应结束后，排出反应混合物，并在氩气保护下用无水DCM洗涤两次。

该实验流程中的关键步骤是双氨基酸偶联。为确保二酮哌嗪环的闭合，我们采用更长的反应时间并加入额外的活化试剂。为促进二酮哌嗪环的闭合，加入 HOAT 和 DIC 溶液，在氩气保护下搅拌反应一小时。

接下来，移除隔膜并排出反应混合物。用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂五次，再用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤五次。本部分涵盖功能化BIS氨基酸的深度保护、Fmoc的深度保护以及第一个BIS氨基酸的酰化反应。

为了对受保护的功能化双氨基酸进行彻底脱保护，缓慢向反应容器中加入2毫升TFA与TIPS的溶液，排液后搅拌反应1小时。用DCM洗涤树脂约30秒，然后排液，重复此DCM洗涤步骤共5次。随后按照A-D-C-M-D-M-F洗涤顺序，重复整个彻底脱保护树脂洗涤流程。用5%（体积/体积）的D-I-P-E-A DMF溶液洗涤树脂两次，以中和树脂。

然后进行另一次D-C-M-D-M-F洗涤。此后，可通过其他官能化的双氨基酸对BIS肽进行延伸，或对前端氮原子上的羧酸进行官能化，或同时进行两种操作。为脱除FM保护基团，加入2 mL含20%哌啶的DMF溶液，混合反应20分钟。

用 DMF 将树脂洗涤五次，然后排干。再额外洗涤一次树脂后，重复此过程一次。最后一步，将制备好的氨基酸溶液加入反应容器中，搅拌六小时，以分离第一个双氨基酸。

用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂五次，再用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤五次。本实验方案的最后步骤包括从树脂上脱除Bach基团以及将氨基酸从树脂上裂解下来。首先，向反应容器中加入2毫升体积比为1:1的三氟乙酸-二氯甲烷（TFA-DCM）溶液，搅拌30分钟。

用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂并排干，重复5次。然后重复此过程一次。分别用二氯甲烷（DCM）和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）各洗涤并排干30秒，每种溶剂各洗5次。

接下来，加入2毫升无水DMF中10% D-I-P-E-A的溶液，搅拌24至48小时。最后，将反应混合物收集至预先称重的圆底烧瓶中。取30微升该溶液转移至液相色谱-质谱（LC-MS）样品瓶中的450微升四氢呋喃（Tetra Hydro FU）中，并提交进行分析。

用额外等份的DMF洗涤树脂，并收集至圆底烧瓶中。在合成过程中，可采用以下方法监测树脂上的化学反应。为检测游离羟基，可进行甲基红试验：首先用一次性移液管取约1毫克干燥树脂。

冲洗后转入一个4毫升的反应容器中。加入按文中所述方法配制的甲基红溶液，搅拌5至10分钟。抽干并用二氯甲烷洗涤树脂5次。若树脂珠呈橙色或红色，表明存在游离羟基。

该检测可用于评估首个双氨基酸加载及树脂封端步骤的效果。为检测是否存在仲胺，可通过一次性移液器取约一毫克干燥树脂转移至小玻璃瓶中，进行氯醛试验。加入三滴0.8毫摩尔的氯醛DMF溶液和三滴2%的酸醛DMF溶液。

然后在室温下静置5到10分钟。在此情况下，蓝色或紫色的树脂珠表明树脂结合的化合物上存在游离的仲胺基团。为确认活化效率，可在合成过程中进行活化捕获测试：将5到10微升活化溶液转移至含有50微升正丙胺的液相色谱-质谱小瓶中，手动混匀，以评估活化化合物的情况。

溶液应变为黄色，持续数秒，然后加入450 µL四氢呋喃稀释，并进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析。最终产物和活化中间体可通过配备C18反相柱以及含0.1%甲酸的水-乙腈溶剂系统的LC-MS系统进行检测。该LC-MS-UV色谱图展示了粗产物高纯度的一个示例。

在21.3分钟处观察到的色谱主峰，其质谱显示的质量与预期产物质量一致。在粗产物的质谱图中可清楚看到这一现象，该峰显示出多个主要离子峰，分别对应于产物分子量本身、产物分子量加钠离子的质量，以及产物分子量减去IV型DDE保护基团质量的离子峰。此处展示的是纯化后产物的液相色谱-质谱（LCMS）紫外吸收图谱，显示在21.3分钟处得到一个纯度很高的产物峰，其质谱图进一步确证了该纯化三肽峰的结构身份。

观看本视频后，您应能充分理解如何在双肽合成技术发展之后，运用固相合成法来制备功能化双肽。掌握该技术后，研究人员可在双肽领域探索其在蛋白质-蛋白质相互作用及催化反应中的应用。若操作得当，该方法可在四到五天内实现功能化双肽三聚体的合成。

进行该实验操作时，务必始终注意保持磁珠浸没在反应液及洗涤液中。此外，还可采用平行合成或文库合成等其他方法，以探究立体化学结构或不同官能团对蛋白质结合能力或催化活性的影响。切记，使用有机试剂可能具有极高危险性，因此在操作过程中必须采取相应防护措施，例如佩戴适当的个人防护装备并在通风橱中进行实验。