固相支持膜电生理学简介

因此，基于固持膜的电生理学（SSM 基础电生理学）是一种新型电生理学方法。与传统方法相比，该方法在多项应用中具有显著改进。

传统电生理学的主要工具是充满电解质的微电极，而基于固相支撑膜（SSM）的电生理学则通过固相支撑膜电极检测电荷的转移。在传统电生理学无法应用的情况下，该方法极具价值，例如对于细菌转运蛋白的研究，除极少数例外情况外，这些蛋白无法通过电压钳或膜片钳技术进行研究。在这些情况下，基于SSM的电生理学方法已被证明非常成功。

它还可用于研究细胞内膜中具有生理相关性的真核转运蛋白。基于SSM的电生理学实验有多种实施方式。在基础研究中，该技术可用于测定动力学参数并阐明转运机制；而其稳定性及自动化潜力使其成为靶点发现中筛选应用的理想选择。

SSM电极携带一种复合膜系统，该系统由底层的SSM以及掺入的蛋白酶体或含有目标转运蛋白的膜片段组成。复合膜的电学特性可通过等效电路进行描述，在该电路中，膜构成一个电容耦合系统。需要注意的是，无论使用膜片段还是蛋白脂质体，该系统的电学行为本质上是相同的。

转运蛋白中的电荷位移通过膀胱膜的电容传递至测量电路，该检测原理称为电容耦合。在典型的实验中，VSSM 上的快速溶液交换为转运蛋白 V 提供底物，随之产生的电致转运活性会生成电流，该电流通过 SSM 电容耦合至测量系统。

与此同时，电致性蛋白的活性逐渐使脂质体膜带电，导致转运蛋白受到抑制，记录电路中的电流随之下降。所测得的电流是吸附在Enzo上的数百万个蛋白脂质体同时发生转运反应的结果，每个脂质体含有约100个转运蛋白。该装置由法拉第屏蔽笼、液体通路、用于阀门控制的外部电路、信号放大系统以及数据采集与分析系统组成。

EC 屏蔽笼包含用于控制溶液流动的容器、阀门和管路，以及一个带有 XOR 芯片的立方体。XOR 芯片承载 SSM 电极和吸附的蛋白脂质体。该装置连接至外部电路的放大器和信号发生器。

SSM 测量，引发电流，两种溶液，一种为激活溶液，另一种为非激活溶液，底物仅存在于激活溶液中。在单交换构型中，两种溶液具有相同的组成。两个两位阀控制非激活溶液和激活溶液的流动。

末端阀门是一种机械耦合的三通三通阀，用于在非激活溶液和激活溶液之间切换，将其中一种溶液导向废液容器，另一种溶液导向qve。当切换末端阀门时，非激活溶液的流动被重新导向废液，而激活溶液则流向qve。该配置可实现两种溶液的同时连续流动。

在流动方案的任何阶段，均可根据需要优化流动路径。但需注意，SSM 与非激活溶液和激活溶液汇合处之间的距离应尽可能缩短，因为该距离决定了溶液交换的时间进程。

电源舱屏蔽笼外的电流放大器连接至一个传感器芯片。通常，放大倍数设置为每安培10的8次方至10的9次方伏特，响应时间为1至10毫秒。函数发生器连接至参比电极，计算机配备阀门控制和数据采集软件，并通过接口盒完成整个系统连接。

接口盒包含阀门驱动器、数据采集系统以及数字输出硬件，溶液流路由0.22微米过滤的加压空气维持。通过数字压力计监测1 bar的压力，该压力可通过调节安装在气源与EC Cage内溶液容器之间的针阀，向钢制储气罐充气来维持。

CVIC 由四个部分组成。zen 芯片夹在 vet 底座和 vet 头之间。一个圆柱形出口连接器被拧到 vet 头上，并承载参比电极组件。

参比电极由一根氯化银丝组成，带有微型 SMC 连接器，并通过聚丙烯酰胺凝胶盐桥与流路隔离。不使用时，将凝胶桥组件保存在含有 100 毫摩尔氯化钾的 100 毫摩尔磷酸钾 pH 7 溶液中。首先，必须将参比电极安装到包含凝胶桥的参比电极组件中。

安装参比电极时应避免产生气泡。现在将该部分的 vete 连接到已预装缓冲液的出口接头。所有连接处必须用 O 形圈密封。

该SM在zor芯片上形成，zor芯片是一种表面涂有山羊膜的结构化玻璃片。该语义导线的宽度为1毫米，直径为1毫米，并通过一条0.2毫米宽的白色导电连接条与焊盘相连。一个弹簧探针与放大器建立连接。

将 zen 芯片置于 10 LAR Okta Deccan 巯基乙醇溶液中避光保存。为维持其神秘的硫醇层并去除未吸附的 Okta Deccan 病毒分子，需用纯乙醇冲洗电极，并用氮气吹干。现在可组装磷胆碱单分子层。

脂质溶液包含每毫升15毫克DFI胆碱和每微克每毫升250微克。Okta two A胺在衰变中，并储存在-20°C。电极现已准确放置在SA尺骨底部。

将1 µL溶液加入SSM电极中，注意不要触碰到金层。添加脂质溶液后，立即组装vete。vete由O形圈密封，呈圆柱形，安装后的内部体积为17 µL。

SSM 应位于入口孔的中心位置。在连接灌流装置之前，流体系统必须预先充满 100 毫摩尔磷酸钾缓冲液。必须确保管路和阀门中无气泡存在。

现在可将电极安装到甲状腺日笼中，连接放大器、溶液流路的入口和出口以及函数发生器。最后，用 100 毫摩尔磷酸钾缓冲液冲洗电极。这将导致SSM自发形成，以检测SSM的质量。

使用函数发生器测量电容和电导，施加100毫伏直流电压进行电导测量。电流衰减反映了膜电容器充电过程，直至电容器完全充电。通过测得的电流，利用M'S定律可得到膜电导。

此处我们观察到电导为 0.17 纳西门子。电容可通过峰峰值振幅为 50 毫伏、频率约为 0.5 赫兹的三角波交流电压进行测量。所得方波电流的振幅代表电容器的判断电流。

电容等于转移电荷除以施加的电压。该膜的电容为2.3纳法，高电导率和低电容表明SSM未正确形成。在这些情况下，应弃用该膜，并使用新的电极芯片制备另一个SSM。

通常，含有蛋白质的脂质体需在零下80摄氏度冷冻保存。样品在冰上进行超声处理至关重要，因为聚集的样品会阻碍其在SSM上形成均匀的含蛋白脂质体悬浮液。超声处理采用三个十秒的循环，每个循环之间在冰上冷却十秒。

用非激活溶液冲洗其SSM。然后将出口连接器连同样品参比电极一起拧下。使用移液器，通过vette的出口将30微升蛋白质样品注入ette体积中。

首先将移液枪头安装到出口孔上。然后在非激活通路中打开上方的手动装置，并注入蛋白脂质体。在移除移液枪头之前完成上述操作。

关闭上方的手动开关，以防止溶液继续流动。让蛋白脂质体在固持单层膜（SSM）上吸附，孵育时间为一至两小时。使用阀控与数据采集软件中的流控协议窗口来定义您的流控程序。

如果需要在对称条件下进行测量，例如测定底物特异性、KM 值或 pH 依赖性，请选择单溶液交换方案。将每种溶液的流速持续时间设置为 0.5 到 1 秒。在整个流速方案过程中持续记录电流。

扩增通常设置为10的9次方，采样率选择每秒2000个数据点。最后，将您的新协议保存为标题“NA a和a”。在流式协议窗口的第二个选项卡中，您可以定义特定阀门的开启或关闭状态，以控制非激活溶液或激活溶液通过qubit的流动。

在此，我们演示了大肠杆菌中蛋白脂质体的测量方法，该蛋白为糖质子同向转运蛋白Y。激活溶液中含有被转运的底物乳糖，而非激活溶液中则含有等量但不被转运的葡萄糖作为补偿化合物。除糖类外，两种溶液均含有pH 7.6的100毫摩尔磷酸钾缓冲液和1毫摩尔二硫苏糖醇（DTT）。

更换溶液后，使用手动阀门确保去除气泡。在开始流动程序之前，应在开始测量前调整压力。我们通常使用 0.6 bar 的压力，在特定的阀门和管路配置下，可产生约每秒一毫升的流速。

然后在此选择一个安全的流式检测程序，即 NAA 程序，并按下启动按钮以开始每次测量。在前几次测量过程中，松散吸附的蛋白脂质体将被去除，因此峰值电流可能会下降。重复测量，直至峰值电流保持稳定。

在非激活溶液流动的第一阶段，电流为零。当溶液从非激活状态转变为含有乳糖的激活溶液时，会诱导膜的生电转运活性。蛋白质的正电荷在蛋白脂质体内部积累，放大器通过固持单膜法（SSM）的正向耦合检测到一个正向瞬态电流。

这种正向耦合电流称为激活溶液产生的“开启”信号V交换。返回非激活溶液时，会诱导质子糖编码从脂质体中转运出来。此时显示的是负向LY耦合电流，即蛋白质动力学分析中所谓的“关闭”信号。

仅使用“开启”信号，因为“关闭”信号由于膜阀切换时的电荷状态会产生机械和电学伪迹，导致信号定义不清晰。幸运的是，这些伪迹仅限于蛋白质诱导信号出现之前的时间范围内。需要注意的是，阀切换伪迹与转运蛋白信号之间50毫秒的延迟，是溶液从末端阀传递到固持膜支持体（SSM）快速溶液交换表面所需的时间。此类在SSM上进行的操作代表了一种典型的弛豫实验。

在此类实验中，电流会通过一个与时间相关的预稳态阶段，逐渐松弛至恒定的稳态。反应循环的电流动力学细节可通过预稳态电流的波形和幅值推导得出。而稳态电流则提供了关于膜蛋白持续 turnover 的信息。

在蛋白脂质体与SSM（支撑性脂质膜）紧密偶联的体系中，脂质体吸附于SSM表面，其初始稳态前电流几乎保持不变。由于脂质体的充电效应，无法获得恒定的稳态电流，而是随着测量时间的推移，测得的电流逐渐减小。通过电路分析方法，可从测得的紧密偶联电流中计算出转运蛋白电流。

在此，我们以 PA 值介于 8.5 至 7.6 范围内的糖质子共转运蛋白（如 Y）为例，展示典型实验结果。该转运蛋白的电流主要由反应循环后期的生电反应主导。在此条件下，前置稳态相表现为简单的电流上升至其稳态值。

随后由于电容耦合而衰减。我们关注的是稳态输运电流。在无膜电位的情况下，该电流可由峰值电流很好地近似表示。

因此，可以通过点印不同底物浓度下的峰值电流来分析Ali Mein动力学，但需注意，只有在同一实验中使用单个传感器获得的峰值电流幅度才能进行严格比较。其中一个原因是吸附效率的变异性。当pH进一步降低时，单相信号会变为双相信号。

最后，对于运输缺陷型 lag Y 突变体，仍存在一个快速瞬变电流。该快速瞬变电流之后跟随一个微弱、较慢的负向组分。这一负向组分是在 ly 偶联系统中测得的快速瞬变电流的特征，由膜电容放电引起。

此处，峰值电流并不代表稳态转运，而是离子循环早期电生性构象转变的体现。这一点之所以显现，是因为 la y 突变体不表现出稳态转运，而对于野生型 lag y，其稳态转运在低 pH 条件下受到抑制。实验结果为 lag y 反应循环中电荷移位的机制提供了阐释，该机制如动力学模型所示。在转运缺陷型突变体中观察到的快速瞬时电流，或在酸性条件下野生型 lag Y 中观察到的现象，源于较高 pH 值下乳糖结合后迅速发生的弱电生性反应；而在反应循环后期，信号主要由主要的电生性反应主导，该反应在电容耦合系统中被推测代表拟似胞质侧质子释放。

这会导致由于Utes之间的强相互作用而产生代表Lag y稳态运输的瞬态电流。使用SSM时，在交换不同组成的溶液时会产生电学伪影。务必使非激活溶液和激活溶液尽可能相似，特别是在pH值和离子强度方面。

应进行对照实验，因为底物本身也可能产生假象。在加入蛋白质样品前，务必使用未修饰的固态膜（SSM）对特定的缓冲体系和流动程序进行假象检测。加入蛋白质样品后，可使用含有与底物结构相似但非底物的化合物溶液进行对照测量。

此外，还可以使用不含目标蛋白的脂质体或膜片段来检测底物是否存在假象。您也可以将抑制剂加入溶液中，或通过移液直接加入。在实验结束后，可将抑制剂直接注入流路出口，以检测转运蛋白信号的抑制情况，此时蛋白特异性信号将消失，仅留下溶液交换产生的假象信号。

随后可轻松校正蛋白质信号。务必确保吸附的蛋白质、脂质体损失或蛋白质降解不会影响您的测量结果。通过在相同条件下进行重复的对照测量，最多达20%的信号衰减是可以接受的，并可通过假设衰减具有线性时间依赖性来进行校正。

该装置是我们实验室经过20年技术发展所取得的成果。此外，我们还提供专门的系统，可用于动力学分析的高时间分辨率实验，以及针对昂贵底物的低溶液消耗实验。对于药物筛选，我们采用具有更高通量的全自动装置。

迄今为止，已有超过 20 种转运蛋白通过该方法得到表征，其中包括转运型 APA、呼吸链复合物、协同转运蛋白、交换体，甚至铁离子通道。因此，当您无法通过标准电生理学方法解决研究问题时，可考虑改用 SS Mase 电生理学方法。