一种利用磁珠进行液相结合捕获分析研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法：以脊髓灰质炎病毒-纳米抗体为例

本方案利用脊髓灰质炎病毒与其识别纳米抗体之间的相互作用，展示一种简单的定量液相亲和捕获检测方法。主要采用钴包被的磁珠来沉淀带标签的蛋白质以及任何相互作用的放射性标记蛋白质。首先，混合标记的和带标签的蛋白质，并在室温下孵育。

然后加入识别该标签的磁珠，利用磁铁将结合了标签蛋白的部分与未结合的部分分离开。接着检测未结合部分中标签蛋白的信号，并确定未结合部分中标签蛋白的含量。当检测对构象转换敏感的蛋白质时，该液相亲和力测定的结果具有极高的应用价值。

这种液相亲和捕获检测方法可用于研究脊髓灰质炎病毒、识别纳米抗体与不同脊髓灰质炎病毒抗原之间的相互作用。只要其中一种蛋白质可被标记，另一种可被检测，该方法也可应用于其他蛋白质-蛋白质相互作用的研究。我们最初开发该方法是出于研究脊髓灰质炎病毒、识别纳米抗体与不同脊髓灰质炎病毒抗原之间相互作用的兴趣。

由于脊髓灰质炎病毒对构象转换敏感，当其附着于固相表面时，ELSA 的应用受到限制。因此，应优先选用基于液相的检测系统。在脊髓灰质炎病毒研究中，常用的液相系统之一是微蛋白检测法。

免疫沉淀实验。尽管该检测方法已证明其适用性，但它需要传统抗体的晶体结构，而纳米抗体缺乏这种结构。这些纳米抗体是具有吸引力且非常稳定的单域抗体，可轻松通过不同的文本进行改造。

该方法被广泛使用。He标签对二价离子（如镍和钴）具有亲和性，而这些离子又可轻松包被在磁珠上。因此，我们开发了基于钴包被磁珠的简单定量亲和捕获检测方法。

涡旋重悬磁珠储备液，每份样品取10 µL转移至离心管中，用磁力架沉淀磁珠。弃去上清液以洗涤磁珠，加入150 µL结合缓冲液。

使用磁铁收集珠子，并在第二次洗涤后弃去上清液。每个样品加入40 µL结合缓冲液重悬珠子以进行对照。对于样品1的背景对照，准备一个不加放射性标记病毒但加入等体积结合缓冲液的孔作为对照。

取两份放射活性为100%的样品。除用结合缓冲液替代纳米抗体外，将所有组分加入孔板中。随后，向所有样品中加入总计80微升结合缓冲液中含有每分钟2000计数的S 35标记的Ⅰ型脊髓灰质炎病毒七型毒株。

接受对照。样品一。向每个样品中加入10 µL的纳米抗体稀释液。

在振荡器上充分混匀10秒，室温孵育1小时。随后加入40 µL洗涤后的磁珠悬浮液，室温下持续振荡孵育10分钟，用磁铁收集磁珠，将上清液转移至另一管中以测定各样品的放射活性，取50 µL上清液加入计数瓶中。加入3 mL闪烁液混合物，在液体闪烁仪上读数。

将使用过的磁珠放入离心管中，用水进行反向拉动，并在500 × g条件下离心2分钟。弃去上清液，将磁珠重悬于6毫升0.5摩尔氢氧化钠溶液中。然后将悬液分装至多个离心管中，在超声水浴中孵育5分钟。

将磁珠在磁力架上离心并弃去上清后，向每根试管中加入1 mL的2% SDS溶液，涡旋混匀后用铝箔包裹，孵育5分钟。随后收集磁珠。向每根试管中加入1 mL 0.2 mol/L、pH 7的EDTA溶液，并将试管置于超声水浴中孵育5分钟。

然后收集珠子，用一毫升水洗涤珠子三次，再用一毫升10毫摩尔氯化钴溶液洗涤。将离心管置于摇床中振荡10分钟。随后将离心管置于磁力架上收集珠子，并重悬于一毫升结合缓冲液中。

用一毫升 20% 乙醇洗涤两次，最后将磁珠重悬于原始体积的 20% 乙醇中，得到浓度为 40 毫克每毫升的再生磁珠。通过设置对照校正本底放射性：将对照样品一设为 0% 放射性值，对照样品二设为 100% 放射性值。

现在，针对每个样品，计算上清液中放射性所占的百分比，以此作为纳米抗体沉淀放射性标记病毒总体效率的衡量指标。本实验通过三种不同的脊髓灰质炎病毒抗原——天然抗原、加热处理抗原和14S亚单位——评估纳米抗体PVSS 38 C及特异性抗脊髓灰质炎病毒抗体的亲和力。有趣的是，含有放射性标记14S亚单位的样品，其上清液中的放射性随纳米抗体PVSS 38 C浓度的增加而降低。这表明与纳米抗体PVSS 38 C结合的脊髓灰质炎病毒14S亚单位数量增加，并间接与磁珠结合。

由于未观察到 pvs S 38 C 与脊髓灰质炎病毒的 N 抗原形式和 H 抗原形式之间存在亲和性，该纳米抗体似乎特异性地针对脊髓灰质炎病毒的 14 s 亚单位。通过本方法测定，该纳米抗体对其抗原的亲和性具有特异性，而无关的纳米抗体 NB one 对脊髓灰质炎病毒的三种抗原形式均无反应性。

该系统具有高重复性，如不同研究人员在不同日期生成的此剂量反应曲线所示。一旦掌握，这种可靠的液相亲和捕获实验可在两小时内完成，包括磁珠的回收利用。观看本视频后，您应能够充分理解如何在研究不同蛋白质之间相互作用时使用基于磁珠的液相亲和捕获实验，尤其是在无法使用固相系统的情况下。