细胞侵入性 DISC1 蛋白物种的生成、纯化与表征

以下实验操作的总体目标是制备纯化的盘状结构。这些结构具有侵入受体细胞的能力。将展示两种不同的方法来实现该目标，首先介绍第一种方法。

在NLF人神经母细胞瘤供体细胞中过表达形成荧光蛋白盘状结构的一号融合蛋白。随后用PBS洗涤细胞，收集并裂解细胞，裂解过程未使用去污剂。消化DNA后，采用蔗糖梯度系统纯化核糖体。

通过该方法纯化的Agrios细胞侵袭效率较低。另一种方法是在大肠杆菌中过表达重组disc one蛋白的第598至785位氨基酸。随后用DITE 594标记该蛋白片段，并通过NI-NTA层析柱进行透析和纯化，以去除任何未结合的染料及多聚体disc。

通过该方法产生的片段具有高效的细胞侵袭能力，可用于评估宿主细胞的侵袭情况。可使用纯化的荧光蛋白圆盘、one risomes 或标记的重组圆盘。将 one 片段与目标受体细胞共同孵育。

随后加入Trian blue以淬灭细胞外荧光，并通过共聚焦显微镜观察侵袭情况。迄今为止，蛋白质聚集尚未被认定为精神分裂症等慢性精神疾病的一个特征。尽管精神分裂症中一种蛋白的异常是细胞侵袭性的候选因素，但蛋白质聚集是蛋白质构象疾病的一个标志性特征。

本文通过两种方法证明，DISC1蛋白聚集体具有细胞侵袭性，因此DISC1相关疾病或DISC1神经病变属于蛋白质构象异常疾病。这两种方法分别是：首先，从神经母细胞瘤细胞系中纯化全长DISC1 ASOS蛋白；其次，在大肠杆菌中表达C端多聚体DISC1片段，并进行纯化及荧光染料标记。

尽管第一种方法仅导致较低的细胞侵袭效率，即仅有约0.3%的细胞摄取了纯化的微粒体，但纯化的重组蛋白片段可感染高达20%的暴露细胞。此处描述的方法应可推广至其他已明确证实存在顶体形成或多聚体组装的蛋白质。每10个10厘米培养皿中。

在补充的 RPMI 1640 培养基中接种 1.5 × 10⁶ 个人类神经母细胞瘤和 LF 细胞，并过夜培养。次日，细胞应达到 70% 至 80% 汇合度，标记五个培养皿用于转染 PC DNA 3.1 MRFP 和 EGFP 标记的人全长 disc 一，另五个培养皿用于单独转染 EGFP 质粒。每 10 厘米培养皿中，加入 15 微克质粒 DNA、30 微升 met affecting 和 750 微升。

在微量离心管中加入Opti MEM，通过移液器反复吹打混匀，室温孵育20分钟。随后进行细胞转染，将DNA转染试剂溶液逐滴加入细胞中，于37摄氏度、5% CO₂条件下继续培养。转染48小时后，通过荧光显微镜检测mRFP全长Disc1的表达情况，并确认agro小体的形成。部分细胞中含有大量荧光蛋白包涵体，如图所示。

本方案结合了一种从脑组织中纯化路易小体的方法以及分离较大聚集体或聚集体区域的方案，因为已有方法均基于去垢剂的使用，而为了在细胞侵袭性检测中应用，分离不含去垢剂的蛋白质至关重要。接下来，吸除培养基，用 PBS 洗涤，并加入含有蛋白酶抑制剂混合物的 400 微升 PBS。然后刮取细胞，将一毫升细胞悬液和 10 个陶瓷珠加入一个两毫升的裂解管中。

使用预冷的细胞裂解24型匀浆器，以三个62纳秒脉冲裂解细胞。该过程的机械力可能导致样品温度升至37摄氏度以上，因此应在冰上冷却样品。裂解完成后，在冰上冷却细胞，然后加入10毫摩尔/升氯化镁和每毫升40单位的DNAA，于37摄氏度振荡孵育60分钟。

分别配制 10 毫升的 80%、50% 和 20%（质量/体积）蔗糖 PBS 溶液。然后在 15 毫升锥形管中制备蔗糖梯度，依次加入 2 毫升 80% 蔗糖溶液、2 毫升 50% 蔗糖溶液和 2 毫升 20% 蔗糖溶液。缓慢倾倒梯度溶液，并注意不要扰动已加入的下层溶液。

将消化后的裂解液小心地铺在梯度液上方，于4°C、1000 × g条件下离心15分钟。离心结束后，用移液器仔细收集50%至80%蔗糖层之间的界面，并与五个体积的溶液混合，转入15 mL锥形管中，于4°C、1000 × g条件下再次离心15分钟。小心弃去上清液，保留含有沉淀的致密区域。

在此界面再重复洗涤两次。农杆菌集落具有荧光性，最后一次洗涤后可在显微镜下通过紫外光观察。弃去上清液，将沉淀重悬于 250 至 500 微升 PBS 中。此沉淀物含有纯化的农杆菌集落。

向含有SHSY5Y人神经母细胞瘤细胞的24孔板的每个孔中加入10 µL MRFP标记的单层囊泡（asome）悬液，这些细胞在无菌玻璃盖玻片上稳定表达C末端融合可溶性GFP。在37°C下孵育48至72小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞三次，并用0.04%台盼蓝孵育5分钟以淬灭胞外荧光。

然后用 PBS 洗涤以去除台盼蓝。接着将培养皿置于冰上，加入 4% PFA 和 PBS 固定细胞 10 分钟。随后用无菌水洗涤一次，并使用抗荧光淬灭封片剂（ProLong Gold）将盖玻片封固在载玻片上。

通过受体细胞在Zack图像中表达的招募蛋白与外源性施加的攻击区域共定位，确认外源性入侵的摄取情况。该Zack区域深度约为六微米。

以200纳米为步长拍摄的24张图像。MRFP标记的农杆菌区荧光（红色）招募了细胞质中的GFPC末端结构域。绿色显示的一个片段与红色共定位时呈现黄色，表明农杆菌区已进入受体细胞质，并招募了原本可溶性的Disc1蛋白。

在本实验步骤中，将使用 DITE 5 94 标记人源 Disc1 蛋白。该标记方法可实现对重组蛋白的直接示踪，无需额外进行免疫染色。首先，按照随附文件所述方法制备蛋白，通过透析去除β-巯基乙醇：将蛋白溶液按 1:2000 比例稀释于两升 PBS 缓冲液中，重复透析三次。

接下来，用DITE 5 94 IDE标记1毫克的圆片1，将一毫克每毫升的蛋白质溶解于PBS中，并加入5毫摩尔的TCEP以恢复游离的TH基团，向反应体系中加入20微升DMF溶解的染料，在室温下孵育两小时。使用截留分子量为10,000道尔顿的SLI透析盒，在PBS中以1:2000的比例透析蛋白质三次，每次两小时。接下来，为进一步提高标记蛋白质的纯度。

在NI-NTA柱上进行基于His标签的亲和纯化。用10毫升PBS洗涤1毫升NI-NTA介质，然后将标记的透析蛋白上样至柱中，并使其流经柱子。

随着蛋白质与NTA介质结合，溶液将逐渐失去部分蓝色，未标记的游离染料会留在流穿液中。待蛋白溶液完全上样后，用20毫升PBS洗涤柱子三次，以洗脱蛋白质，然后向柱中加入2毫升含有500毫摩尔咪唑的PBS。

将阀门调至低速，同时监测 N NI NTA 柱上的有色条带，逐滴洗脱。需要说明的是，该有色洗脱组分含有标记的重组蛋白，将 EIT 转移至 SLI 透析盒中，并在透析后用稀释至 1:2000 的 10 毫摩尔 NAPI 缓冲液透析三次，每次两小时，每次使用两升缓冲液。将 EIT 通过 0.45 微米无菌注射器滤器过滤，然后分装为五份 100 微升样品，立即在液氮中速冻。

每100微升分装样品中的总蛋白量应为0.5至1微克/毫升。为评估蛋白的侵入性，向含有受体SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的24孔板的每个孔中加入含5至10微克/毫升标记的重组Disc1蛋白的培养基。在无菌玻璃盖玻片上持续表达可溶性GFP标签Disc1 C末端，孵育48至72小时。

淬灭细胞外荧光后，固定并封片，操作步骤与处理农杆菌区域细胞相同，随后通过扎克成像（Zack Imaging）确认外源施加的重组蛋白是否入侵。当标记的蛋白被摄取后，可在共聚焦显微镜生成的图像中观察到其位于受体细胞轮廓内部。该扎克成像的扫描深度约为五微米，共24步，每步220纳米。

此处，呈红色的重组 Disc1 蛋白片段（598 至 785 位氨基酸）被表达可溶性 C 末端绿色荧光蛋白（GFP）标记 Disc1（呈绿色）的受体细胞摄取，以评估 Disc1 蛋白的侵袭性。由 MRFP 全长标记的 Disc1 蛋白聚集体（acrosomes）从 NLF 细胞中纯化，并按照本图所示方法施加于受体 SH-SY5Y 细胞。如图所示，MRFP 标记的 Disc1 顶体侵入了表达可溶性 GFP 标记 C 末端 Disc1 的人源神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞。

此外，带有MRFP标签的disc one asome能够将可溶性GFP标签的disc one招募到不溶性聚集体中，以确定DIA轻标记的重组disc one的侵袭性。如图所示，将重组disc one蛋白（以红色显示）应用于表达可溶性GFP disc one的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，黄色点状信号表明可溶性GFP标记的C端disc one被招募至聚集体中。从大肠杆菌表达并纯化的重组disc one蛋白在体内也表现出对神经元的细胞侵袭性，当将该多聚体蛋白通过立体定位注射至大鼠内侧前额叶皮层时，Zack成像证实了重组disc one蛋白存在于大鼠皮层神经元中，该结果通过神经元核特异性抗体染色得以确认。

我们刚刚向您展示了两种用于生成盘状蛋白一聚集体以研究细胞侵袭的方法。通过使用其中任意一种方法，我们可以在不涉及外源DNA转染所导致的重组基因表达等潜在干扰变量的情况下，研究细胞摄取盘状蛋白一聚集体所产生的细胞效应。这些技术可用于在体外研究盘状蛋白一蛋白病理的生物学效应，也可通过脑内接种或其他给药方式在动物模型中进行体内研究。

我们相信，这些技术最终也可能通过略微修改针对特定蛋白质的实验方案，而应用于其他蛋白质聚集体。进行此操作时，务必要留出充足时间，仔细分析共聚焦显微镜图像。