无需蛋白质纯化的微量热泳动结合亲和力测定方法

本实验的总体目标是在不从细胞裂解液中纯化蛋白质的情况下，测定蛋白质与配体相互作用的结合亲和力。首先在任意贴壁细胞系中表达目标GFP融合蛋白，然后制备细胞裂解液和配体稀释液，将裂解液与配体混合后装入毛细管中，从而实现该目标。

接下来，测定在不同配体浓度下GFP融合蛋白的热泳稳定性。最后一步是微尺度热泳（MST）测量数据的分析。最终，利用微尺度热泳技术来确定GFP融合蛋白与多种配体之间相互作用的结合亲和力。

与滴定法、量热法或表面等离子体共振等现有方法相比，该技术的主要优势在于无需进行蛋白质纯化，从而显著简化并加速了对二元相互作用的定量表征。当研究难以表达和纯化的蛋白质（如膜蛋白和转录因子）时，该方法具有显著优势。微尺度热泳技术最大的优点之一是其可在多种缓冲体系中进行，并能耐受体系中去垢剂和胶束的存在。本实验技术将由我实验室的生物学家 Karen Stefka 演示。开始时，使用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS），每 T75 培养瓶加入 10 毫升缓冲液，短暂洗涤细胞。

将细胞置于冰上5分钟，或直至细胞开始从培养瓶脱落。如有必要，使用细胞刮刀轻轻刮取以促进细胞脱落。用10毫升预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，并转移至预冷的14毫升圆底离心管中。

以400至600 G、4摄氏度离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，将沉淀物重悬于200微升预冷的裂解缓冲液中。将悬液转移至预冷的1.5毫升离心管中，用于提取胞质蛋白。

将细胞置于冰上以尽量减少局部过热，并使用30%振幅的超声处理，进行三次、每次十秒的脉冲破碎。使用2至3毫米的预冷探头，并保持探头位于液面以下，以减少起泡。若使用含去污剂的缓冲液，则省略此步骤，并在冰上孵育30分钟。

必要时，使用5摩尔的氯化钠储备液，将裂解液调整至生理盐浓度，即含100毫摩尔的氯化钠。最后，在4摄氏度条件下，以约25,000 ×g离心10分钟，收集裂解液。在MST仪器上选择波长为470纳米的发光二极管（LED）作为激发光源。

用MST缓冲液将细胞提取物稀释2倍和10倍后上样至毛细管中，并将毛细管放入MST仪器。在MST仪器的控制软件中执行“寻找毛细管”操作。稀释裂解液中的最佳荧光范围为400至1500荧光单位。

按照文本方案中所述，确定最佳配体浓度范围。将装有适量0.5毫升低吸附离心管的试管架置于冰上，用移液器向每管底部加入25微升MST缓冲液，向第一管中加入25微升配体储备溶液，然后利用其余各管对配体进行连续两倍稀释。将装有配体样品的试管架始终保持在冰上。

计算细胞裂解物的稀释倍数，以在结合反应中获得荧光标记靶蛋白的最佳水平。最终蛋白浓度应接近或低于预期的结合解离常数，并应根据需要调整以获得足够的荧光计数。在最终溶液中，使用MST缓冲液对细胞裂解物进行稀释。

将0.5毫升低吸附离心管放置于装有配体倍比稀释样品离心管对面的试管架中。小心地将15微升细胞裂解液加入每根离心管底部，尽量避免接触管壁，以防样品损失。

将浓度最高的配体样品15微升加入相应的试管中，即含有细胞裂解液的第一管。充分混匀，并更换移液器吸头。

除最后一管（不含配体）外，对其余各管重复此步骤。向最后一管中加入15微升MST缓冲液并混匀。用第一管中的结合混合液填充第一根毛细管约三分之二的体积。

倾斜以使溶液向中心移动，并将毛细管放置到毛细管托盘的指定位置。从编号一开始，对剩余的毛细管重复此步骤。对于较长时间的实验，可用石蜡封堵毛细管末端。

将样品架放入 MST 仪器内，并关闭仪器门。接着，选择波长为 470 纳米的 LED 激发光源。在 MST 仪器上执行“寻找毛细管”命令，使仪器确定毛细管的精确位置，并根据荧光信号强度测量样品的荧光值。

调节LED功率，使其处于400至1500单位区间内。点击开始按钮以执行热阻实验。实验中可选择多个红外激光功率。

为了确定特定系统的最佳温度梯度，运行一组16根毛细管需要10到12分钟。对同一组毛细管重复进行两到三次运行，以确保测量结果的可重复性。开始数据分析时，打开分析软件并加载项目文件夹。

在出现的信息运行查看器中，选择在特定红外激光功率下采集的热泳曲线。可以选择一次性打开在不同条件下采集的所有热泳轨迹，然后通过开启或关闭来选择任意曲线进行分析。在评估点图窗口中，选择具有T跳变的热泳或热对流曲线，其中蓝色和红色线条分别表示。

在软件分析中，手动选择实验曲线的两个区域。确保蓝线和红线位置正确，以获得热阻抗的最大变化。为获得带有标准偏差的平均数据点，请选择使用平均值，或针对单独的实验运行进行区分。

为了绘制解离常数拟合曲线，选择使用平均值，输入并固定标记分子的浓度值，然后拟合曲线。结合解离常数（KD值）及其标准偏差将显示在单独的信息弹出窗口中。将平均拟合数据保存为文本文件，并导入Excel。Heck。

表达 STAT3-GFP 的 293 细胞被用作荧光标记的 STAT3 蛋白来源。在 DNA 结合实验中，高电荷寡核苷酸的结合导致 STAT3 迁移率发生显著变化。在温度梯度中。

热漂移信号绘制为寡核苷酸浓度的函数。每个数据点代表三次测量的平均值。采用纳米时间分析软件进行拟合并确定表观KD值。

与 gas 基序结合的表观解离常数为 37.9 ± 1.0 µM，与富含 A-T 的寡核苷酸 s plus 100 结合的表观解离常数为 23.3 ± 0.6 µM。令人意外的是，s plus 100 序列的结合亲和力略高于 gas。在三次重复测量中，将 A 替换为 G 导致 s plus 100 突变体 1 的亲和力显著下降。

尽管 s plus 100 突变体二未显示出可检测到的结合信号，从而证实了 STAT 三对 s plus 100 的序列选择性结合。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在进行该实验时，重要的是要记住，不同膜蛋白的最佳提取条件各不相同，通常需要优化。观看本视频后，您应能够充分理解如何在无需将蛋白质从细胞裂解液中纯化的情况下，测定蛋白质与靶标之间的结合亲和力。