用于测量间质流体流动对肿瘤细胞侵袭影响的三维细胞培养模型

本实验的目的是使三维培养的细胞暴露于间质液流中，并量化流体介导效应对细胞侵袭的影响。首先制备含有Ⅰ型胶原蛋白和基质胶（matrigel）的凝胶溶液，第二步是向凝胶溶液中加入特定浓度的细胞。

接下来，将细胞悬液加入直径为12毫米、孔径为8微米的Transwell小室中，并在37摄氏度下孵育，直至基质凝胶。实验设置的最后一步是向Transwell小室中加入特定体积的培养基，以建立静态和流动条件。24小时后，对Transwell膜进行固定、染色，并观察以定量分析侵袭细胞的数量。

与现有方法（如微流控、间质流体腔室）相比，该技术的主要优势在于无需使用泵或专用设备，且研究人员可方便、快速地测试多种条件或处理方式。尽管该方法可用于研究细胞迁移和侵袭行为，但也可用于或适用于探究间质液流对其他重要细胞行为的影响，例如蛋白质表达、细胞增殖以及细胞信号通路的改变。演示本实验操作的将是一位 LIMA two chaa。

我实验室中的一名研究生开始该实验时，先将少量基质胶置于4°C的冰上。接着，使用PBS、无菌水、氢氧化钠、基质胶和大鼠尾部I型胶原蛋白配制凝胶溶液。然后在冰上按相同顺序混合凝胶各组分，并将最终溶液在4°C孵育一小时。

现在使用一对灭菌镊子将一个直径为12毫米、孔径为8微米的细胞培养小室插入12孔板中。然后计数细胞，并将其重悬于无血清培养基中，浓度为每毫升5×10⁶个细胞，将100微升细胞悬液加入900微升凝胶溶液中。随后，通过轻轻吹打混匀。

随后，将150 µL终末混合液加入每个插入物中。然后将插入物转移至37 °C、5% CO₂培养箱中孵育30分钟，直至凝胶聚合。对于静态条件，在凝胶上方加入100 µL无血清培养基，插入物下方加入1,200 µL。

小室中插入物内部和外部的液面应大致相等，以使凝胶两侧的压力差最小化，并避免间质流动。对于流动条件，需在插入物下方加入 100 µL 无血清培养基，上方凝胶处加入 650 µL。同时，应尽量避免在插入物下方产生气泡，因为气泡会阻碍细胞在这些区域通过膜迁移。

然后将培养板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育24小时。在此步骤中，向一个新的24孔板中每孔加入500 µL的1× PBS，用于洗涤小室插件。随后移除流式趋化小室上层残留的培养基。

接下来，使用棉签从插入物中去除凝胶。擦拭膜表面的上层以去除非血管生成细胞。然后将插入物放入含有1倍PBS的24孔板中，孵育15秒以清洗插入物。

随后，吸除 PBS，并在每个插入膜下方加入 500 µL 的 4% 多聚甲醛。于室温孵育 30 分钟，以固定迁移后的细胞。然后吸除多聚甲醛，用 500 µL PBS 洗涤一次，以去除残留的固定剂。

接下来，在插入物下方加入 500 微升 0.5% Triton X-100 溶液，并在室温下孵育 10 分钟。为了通透细胞，使用刀片将膜从插入物上切割下来。然后将其放入含有 100 微升、每毫升含 2 微克 DPI 的 1× PBS 溶液中。

注意将膜的底面朝下放置。DPI 溶液须在使用前几分钟配制，并避光保存。现在用铝箔纸将板包裹起来。

将样品置于摇床中，150 RPM 室温振荡 30 分钟。随后用 500 微升 PBS 洗涤膜一次，并将膜重新放回摇床中振荡 10 分钟。为去除游离的 jy，再重复洗涤两次。

下一步是将膜置于载玻片上，确保发生迁移的细胞面朝上。向膜上加入封片液，然后盖上盖玻片。

随后，对染色的细胞核进行计数，并根据随附的文稿计算侵袭细胞的数量。该图显示了穿过膜的MDA-MB-435 s细胞。在间质液流侵袭实验后，将已侵袭的细胞固定，并使用DPI以及与Alexa Fluor 488偶联的鬼笔环肽（foidin）进行染色，以便于对侵袭细胞进行计数。

这是明场下的膜，以及染色后呈斑点状的细胞核。此处显示的是用鬼笔环肽标记的 F-肌动蛋白，其荧光染料为 Alexa Fluor 488。该图表表明，间质流显著增强了 MDA-MB-435 s 转移性黑色素瘤细胞的侵袭能力。

24小时后，结果将标准化为静态侵袭条件的平均值，并展示六个细胞培养小室的平均值。不同条件之间的差异具有统计学显著性，P值为0.003。一旦掌握，间质液流检测可在2小时内完成设置，随后进行24小时的孵育，再用2小时对转移膜进行固定和染色。

通过该实验步骤，可轻松提取细胞、蛋白质或核酸，以回答更多问题，例如基因和蛋白质表达如何响应组织间液流动而发生变化。自建立以来，该方法已成为研究组织间液流动对癌细胞影响的科研人员所必需的一项关键检测手段。