使用多层水凝胶生物墨水进行三维生物打印以实现均匀的细胞分布

采用我们的方案，液态生物墨水稀释液的多层叠加不仅促进了包封细胞的均匀分散，还维持了适合细胞生存的生物墨水环境。我们利用界面张力阻止包封细胞在生物墨水储液池中的沉降，从而避免了挤出打印过程中细胞所承受的高剪切应力。通过该技术，我们能够制备出细胞分布均匀的三维组织构建物，为药物筛选和再生医学研究提供功能性的体外组织模型。

在制备生物墨水时，需要注意实验温度和水凝胶的加载程序，因为这些因素可能影响墨水的质量。在开始制备前，使用0.22微米注射器滤器单元对所有材料进行灭菌，并在生物安全柜中将明胶溶解于50摄氏度的PBS中，使其终浓度为10%。在50摄氏度下，以0.6比1的重量比将甲基丙烯酸酐缓慢加入明胶溶液中，并持续搅拌至少一小时。

孵育结束后，将混合溶液转移至无菌的50毫升离心管中，通过离心将溶液分离成不同层。收集上层的GelMA层，并用两倍体积的40至50摄氏度去离子水稀释收集的溶液。使用截留分子量为12至14千道尔顿的透析膜，在40至50摄氏度条件下对GelMA溶液进行透析，持续5至7天，每天更换透析水两次。

透析结束后，将 GelMA 溶液在 -80 °C 下冷冻过夜。随后将 GelMA 溶液置于冻干机中，在 -45 °C 和 0.2 毫巴压力下冻干 3 至 5 天。然后将冻干后的 GelMA 溶解于添加了 10% 胎牛血清、25 毫摩尔 HEPES 和 0.5% 光引发剂的 PBS 中。

为制备丝素蛋白 GelMA 生物墨水，按照表格中的建议，将 GelMA 溶液与不同体积的初始丝素蛋白溶液及不同体积的 PBS 混合。所有生物墨水配制完成后，将溶液超声处理 10 至 20 分钟。在墨水超声的同时，从 80% 汇合度的 NIH/3T3 细胞培养物中收集细胞，每种生物墨水溶液对应一个 15 毫升锥形管，并通过离心形成细胞沉淀。

然后小心吸除上清液，并将每管中的细胞用 2 毫升生物墨水重悬，细胞浓度为每毫升生物墨水溶液含 1 × 10⁶ 个细胞。为加载用于打印的生物墨水，取 400 微升含细胞的丝素蛋白 0.5% GelMA 生物墨水加入到 2 毫升注射器的底层。将注射器置于 0°C 冰水浴中 5 分钟，使底层生物墨水转变为凝胶状态，随后在丝素蛋白 0.5% GelMA 层上方加载 400 微升含细胞的丝素蛋白 0.75% GelMA 生物墨水。

然后将注射器放回冰浴中持续五分钟，并以相同方式继续向注射器中逐次加入含细胞的生物墨水的不同浓度溶液。当获得具有不同丝素蛋白浓度的多层生物墨水体系后，将生物墨水置于37°C培养箱中重新加热30分钟。孵育结束后，将27号打印喷头安装到注射器上，设置流速为50微升每分钟，喷头移动速度为2毫米每秒，喷头高度为1毫米。

接下来，使用定制的生物打印机在室温下以挤出方式打印组织构建物，并用365纳米紫外光在800毫瓦功率下交联生物打印的组织构建物40秒。然后将交联后的组织构建物置于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，在细胞培养箱中进行培养，前两天每八小时更换一次培养基，之后每两至三天更换一次。在此代表性分析中，随着生物打印过程的进行，各组目标孔中的细胞密度均有所下降。

在丝素蛋白零层 GelMA 组中，约 70% 的细胞沉积在底层。在丝素蛋白一层 GelMA 组中，约 40% 的细胞沉积在底层，约 5% 的细胞沉积在顶层。在丝素蛋白多层 GelMA 组中，包封细胞的沉积比对照组更均匀。

该方案最关键的步骤是SF-GelMA生物墨水多层结构的加载。本方案也可应用于其他使用类液体生物墨水的挤出式生物打印分析。