在二维和三维I型胶原基质上评估角质形成细胞的增殖

本视频展示了如何使用I型胶原蛋白以及二维和三维培养方法制备两种不同类型的细胞培养基质。三维培养方法更接近生物体内的生理环境，因此演示如何简便地制备三维培养基质对相关研究具有重要意义。尽管使用相同的胶原蛋白，多种细胞类型在二维与三维基质上的行为表现存在显著差异。

利用三维培养基质，可以更简便地观察到与生物体内更为相似的细胞行为。该方法非常简单，且仅需极少的特殊试剂。直观演示至关重要，因为尽管我们希望表明该方法易于尝试，但三维凝胶较为脆弱，正确操作处理极为重要。

首先，准备好合适的培养基。开始制备胶原时，将10× PBS、去离子水、胶原、96孔培养板和一个空的2毫升离心管置于冰上。使用移液器，向空的2毫升离心管中加入1.12毫升的去离子水。

向去离子水中加入 200 微升 10 倍浓度的 PBS，轻轻振荡管子数次。使用前立即向 2 毫升离心管中加入 0.66 毫升胶原蛋白，然后迅速而轻柔地振荡管子数次。

将100微升该胶原蛋白溶液加入96孔培养板的每孔中，确保完全覆盖孔的表面。轻轻左右摇动培养板。将培养板置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育1小时。

然后倾斜培养板以确认胶原蛋白的凝胶化，并将培养板转移至超净台。沿孔壁轻轻加入150微升K110，使用移液器小心滴加。在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育1小时。

此后，将培养板转移至超净工作台。在进行细胞培养前，立即使用移液器轻轻弃去 K110。首先，用移液器将 4 微升胶原加入含有 1.2 毫升 1 毫摩尔盐酸的 1.5 毫升离心管中，并轻轻混匀。

将100微升该胶原蛋白混合液加入新的96孔培养板的每孔中。轻轻左右摇动培养板，室温孵育1小时。之后弃去胶原蛋白溶液。

使用移液器用 PBS 洗涤每个孔。向培养板的每个孔中加入 150 µL 含 1% BSA 的 PBS，于室温孵育 1 小时。在进行细胞培养前，弃去 1% BSA 溶液。

首先，按照文本方案准备 FEPE1L-8 细胞以及 K110、胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂。小心吸去培养皿中的培养基，用移液器加入 3 毫升 0.05% 胰蛋白酶。将培养皿放回二氧化碳培养箱中，在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。

然后使用10倍放大倍数的相差显微镜检查细胞是否从培养皿表面脱落。加入3毫升胰蛋白酶抑制剂，用移液器将脱落的细胞收集至15毫升离心管中。在200 × g条件下离心5分钟。

此后，弃去上清液，并将沉淀重悬于 10 毫升 K110 中。使用 10 倍物镜的相差显微镜对细胞进行计数，并用 K110 将细胞稀释至密度为每毫升 50,000 个细胞。用移液器沿培养板孔壁缓慢加入 0.1 毫升细胞悬液至每个孔中。

在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育适当时间。首先，在2毫升离心管中将130微升四唑盐和WST-8与1.3毫升预热的K110混合。将培养板转移至超净工作台，用移液器轻轻弃去孔中的K110。

用 K110 轻柔洗去非贴壁细胞。然后向每孔加入 110 微升与 WST-8 混合的 K110。在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育两小时。

此后，将培养板转移至超净工作台。从每个孔中收集 100 微升条件培养基，并将其转移至新的 96 孔培养板的孔中。使用酶标仪在 450 纳米处测定吸光度，并估算活细胞数量。

观察到细胞在非纤维状和纤维状形式上的形态。在培养的最初两小时内，细胞在这两种形式的胶原上均发生黏附和铺展。接种三天后，非纤维状形式上的细胞继续铺展，且细胞数量增加，而纤维状形式上的细胞则表现出有限的铺展。

FEPE1L-8 细胞在 I 型胶原的非纤维形式以及未经处理的培养皿表面仍能持续增殖。相比之下，细胞在纤维形式的胶原上不增殖。在进行该操作时，需注意三维凝胶非常脆弱。

必须注意确保溶液或吸头不与凝胶直接接触。该方法可通过多种方式进行修改。例如，为了混合样品的膜组分，可以制备一种模拟基底膜的细胞培养基质。

在许多情况下，生物体内细胞外基质的功能尚不明确。通过在三维培养条件下培养细胞，可以研究更接近生物体内环境的细胞外基质组分的功能。应用三维凝胶培养技术，可有效检测药物在细胞中的浓度。

根据研究目的，本方案可在凝胶过程中通过添加其他 EGM 成分或生长因子，用于构建复杂的三维培养基质。