利用原子力显微镜量化内皮糖萼的机械特性

以下实验的总体目标是利用原子力显微镜或磁性镊子测量内皮糖萼的力学特性。首先，在生物反应器中于生理流动条件下培养一层内皮细胞，以形成糖萼层，此为第二步。将微米级小球连接到磁性镊子悬臂上，作为探针用于测量压痕过程中细胞本体及糖萼的阻力。随后，采用双层模型对压痕曲线进行拟合，以确定糖萼的模量和厚度。通过双层分析获得的结果显示，内皮糖萼的模量为0.7千帕，厚度为380纳米。

大家好，我是罗切斯特大学生物医学工程系主任 Rick Wa。近年来，关于内皮糖萼在炎症过程中可能发挥的作用存在大量讨论，特别是它是否可能作为一种保护性屏障，防止在炎症期间发生不必要的细胞黏附。要解决围绕这一问题的争议，关键在于能够测量该结构的物理特性，即其在正常状态以及炎症反应过程中的厚度和刚度。

我是格雷厄姆·马什（Graham Marsh），罗切斯特大学生物医学工程系的一名研究生。在表征内皮糖萼时面临的主要难题在于，它极其柔软。

我们提出的方法是在原子力显微镜（AFM）悬臂末端附着一个较大的微珠，以便所测得的力能够通过原子力显微镜（AFM）清晰分辨。开始此操作前，构建一个如图所示的流动腔室，该腔室能够使细胞在1.0帕斯卡的剪切应力条件下生长。首先用“piranha”溶液清洗载玻片15分钟，以清洁流动腔室，然后用蒸馏水冲洗三次，并在70摄氏度下干燥30分钟，完成实验前的腔室准备工作。

接下来，通过气相沉积法用氨基丙基三甲氧基硅烷（amino propyl triethoxysilane）、氯丙基三乙氧基硅烷（cy lane）或 APTES 对载玻片进行包被。将 1 毫升 APTES 加入与真空室相连并含有样品的烧瓶中。然后密封烧瓶，并在 0.7 巴的真空度下抽气 1 小时。

在此期间，重复刷新真空三次。接下来，使用Silhouette SD切割工具从厚度为0.4毫米的硅胶片上切割出一个新的流室垫圈。通道尺寸为6.4毫米宽、19毫米长，外径切割为35毫米，以便能够适配于Asylum培养皿中。

根据这些参数，利用此处所示公式计算产生一帕斯卡剪切应力所需的流速。Q 表示流速，Tau 表示剪切应力。

μ 是介质的黏度。H 是通道高度，W 是流动室的宽度。下一步是将流动室的上部与细胞培养皿中的垫圈对齐，并用磁环固定。

将细胞培养皿中的流路接口通过管路连接至三个波浪阀，并连接到30毫升注射器。然后用异丙醇冲洗整个装置五分钟，进行灭菌。随后移除异丙醇，并在组织环境中静置晾干。

在培养罩中将含4%胎牛血清的McCoy's培养基预热至37摄氏度。静置干燥5到10分钟后，用30毫升预热的胎牛血清冲洗残留的酒精。然后用20毫升veek MCDB 131生长培养基填充注射器。

接下来，盖上注射器帽以防止污染。当将系统移出无菌操作台时，将收集储液罐的帽盖安装好，并连接可伸入液体中的针头，以将培养基回抽至上游储液罐。最后，在下次收获人脐静脉时，将0.2微米的无菌滤器连接到帽盖的进气口上。

在T 25培养瓶中生长至融合的内皮细胞。用培养基将沉淀的细胞重悬至100,000个细胞/毫升，吸入注射器中，然后通过三通阀将细胞悬液注入流动室。

让细胞沉降并贴附在玻璃基质上，持续两小时。在开始流动之前，将生物反应器和细胞移入培养箱，使细胞在培养箱中继续沉降并贴附两小时。连接储液器与蠕动泵的管路从培养箱背部穿过。待细胞贴附后，将蠕动泵设定至所需的流速。

培养基在储液器之间流动，形成压力差，使流体通过生物反应器，从而产生一帕斯卡的壁面剪切应力。在37摄氏度下持续灌注培养细胞一至五天，直至腔室内的细胞达到汇合状态。开始制备悬臂梁时，先将探针和FM悬臂梁在硝酸中清洗五分钟，随后用蒸馏水冲洗。

干燥后，将悬臂梁置于气相沉积室中，用 apdi 进行功能化处理，方法与之前处理玻片的方法相同。然后，用汉克平衡盐溶液配制每毫升含五毫克 NHS Sulf O lc、生物素的溶液。将悬臂梁浸入该溶液中 15 分钟。

该反应将CY与末端羟基氧化物连接，并在悬臂表面呈现生物素分子。实验前一天，通过将含有20%血清的20毫升Vexcel培养基与200微升链霉亲和素包被的磁珠混合，开始制备无生物素培养基溶液，并在旋转条件下孵育12小时。实验当天。

将磁珠用磁铁吸附至管底，静置两分钟，然后将含有无生物素培养基的上清液转移至新管中。使用0.22微米滤膜过滤培养基以实现灭菌，并将其转移至新管中。下一步是将流室从细胞培养皿中取出，然后用两毫升37摄氏度的无生物素培养基洗涤细胞三次。

然后向培养皿中加入一微克直径为2.4微米的去涂层腺病毒包被微珠，终浓度为每毫升10微克，并轻轻混匀。接下来，通过将原子力显微镜（AFM）探针尖端连接至一个去涂层微珠，并将其压入普通玻璃表面，以校准AFM探针。

为了实现这一目标，先将探针尖端置于玻璃表面靠近微珠的位置，随后收回探针，再将悬臂的顶端定位至微珠上方，向下按压数秒。最后，使用已校准的悬臂对样品进行压痕测试。2.4 微米的微珠可提供更大的接触面积，与细胞表面接触时能更有效地检测柔软糖萼层的力学特性。

为实现此定位，将悬臂置于细胞核附近的细胞上方，使探针以较轻柔的方式接触细胞表面，从而将悬臂高度设定在细胞表面以上约三微米处。随后以每秒一微米的速度对表面进行20次压痕，最大作用力为七纳牛，在连续两次接触之间间隔六秒。

使用与赫兹理论相关的公式计算糖萼层的厚度。压痕力 F 由该公式描述，其中 delta 为压痕深度，R 为球体半径，estar 为受力材料的组合模量。

为了将综合弹性模量 estar 分离为细胞和糖萼组分，可将糖萼层视为细胞体表面一层均匀的薄而柔软的膜，并采用 Clifford 和 C 提出的双层模型。在该方程中，PQ 和 N 是通过聚合物拟合经验确定的常数。M 是聚合物模型中的一个常数，Z 则与薄层或糖萼层的厚度通过此处所示方程相关联。原子力显微镜（A FM）以纳牛顿（nano Newtons）测得的力在接触表面后开始增加，初始阶段主要由糖萼层组分主导。

当糖萼层被压缩后，细胞体成为变形的主要组成部分。通过拟合四个自由参数，计算出蓝色的双层拟合线，使其与红色所示的压痕数据相匹配，所用方程可确定细胞模量、糖萼层模量以及糖萼层厚度。来自25个细胞的特性数据被汇总成此处所示的直方图。

糖萼层的平均模量确定为 0.7 ± 0.5 kPa，糖萼层厚度确定为 380 ± 50 纳米。该方法为我们提供了回答关于糖萼在炎症过程中调控细胞黏附作用这一基本问题所需的工具。我们现在能够探究糖萼的特性在炎症期间如何发生变化。

通过何种方式实现这些变化。该方法可以通过多种方式加以扩展。例如，可以利用该方法来检验关于糖萼特性的新颖且更为复杂的理论描述。

或者从更实际的角度来看，人们或许可以利用这种方法来测试仿生表面涂层，这些涂层旨在保护可植入设备免受宿主免疫反应的影响。非常感谢您对我们工作的关注。