通过跨物种移植分析神经嵴细胞的迁移与分化

本实验的总体目标是将鹌鹑胚胎的背部神经管外植体移植到与之发育阶段匹配的鸡胚胎中，以示踪神经嵴细胞的迁移与命运。该过程首先在宿主鸡胚胎的 IGN 膜上撕开一个小孔，以暴露神经管。随后将供体鹌鹑胚胎从蛋中取出，为其后续的移植组织切除做准备。

下一步，从宿主胚胎的神经管中切除目标区域。随后，从供体神经管中切除相似区域用于移植。接着，将供体神经管移植到宿主神经管中。

最后，将嵌合胚胎孵育至所需阶段，以检测到达目标器官的神经嵴来源细胞。最终，可通过免疫荧光显微镜观察供体来源的神经嵴细胞在宿主胚胎内向不同部位的迁移与分化过程。该方法的可视化演示至关重要，因为显微解剖与移植步骤需要极为精细的操作技能，难以通过文字描述掌握。

首先用温水清洗鸡胚蛋表面的碎屑。将蛋水平放置在托盘上，然后用铅笔标记朝上的侧面，以标明胚胎将要定位的区域。对于供体胚胎的 X ovo 准备，将鹌鹑蛋钝端朝下孵育。

接下来，将鸡蛋放入38°C的湿润培养箱中，并开启摇动功能。待鸡蛋完成培养后，用70%乙醇喷洒其表面进行消毒，然后迅速用无尘纸（kim wipe）擦干。为避免液体通过蛋壳吸收，将每枚已消毒的鸡蛋放置在独立的蛋托上，蛋托内可衬有折叠的无尘纸，如图中培养皿所示。随后使用已灭菌的AA镊子，轻轻在鸡蛋尖端的蛋壳顶端表面敲击出一个小孔。

使用一个5毫升注射器，并安装一根18.5号的皮下注射针头。然后将针头斜面朝向蛋的尖端，垂直插入蛋壳上的孔中。为避免因负压意外损伤蛋黄，先用70%乙醇按前述方法清洁小孔，再用透明胶带封住小孔。

然后用双A镊子在水平支上表面标记处轻轻敲击，打一个孔，位置接近但不完全在顶端。接着，将弯曲虹膜镊的一侧平行于蛋的方向插入孔中，夹住蛋壳并以环形动作向下施压，逐步剥离蛋壳。

在鸡蛋上打破一个直径约两厘米的窗口，移除并丢弃蛋壳碎片。胚胎应呈现为位于蛋黄上方的不透明圆盘状结构。若蛋黄表面仅有一个小白点，或缺乏外胚层（blaster derm），则表明为未受精卵，应予以丢弃。

现在，在佩戴适当的护目镜后，从针头基部开始，将一支26号半规格的皮下注射针在45度角处弯曲。将弯曲后的针头斜面向上连接至一支1毫升注射器上，然后用稀释的印度墨水充满针头。在囊胚边缘以外的位置刺破卵黄膜，并将针头尖端滑入胚胎下方，靠近卵黄表面，但不要进入胚胎层内。

然后注入适量墨汁以勾勒出胚胎轮廓，避免注入气泡。小心抽出针头。现在使用体视显微镜和热负荷较低的光源，例如此处所示的光纤鹅颈灯。

根据哈姆布格尔和汉密尔顿分期法对胚胎进行分期，并在蛋壳上记录分期结果。随后在胚胎表面滴加两到三滴温热的无菌林格溶液，以防止脱水和污染。

然后在卵的表面覆盖一层封口膜，以暂时封闭窗口。接下来，准备鹌鹑卵用于移植。在将卵从培养箱中取出之前，先在培养皿中加入林格溶液。

然后用弯头镊子从鸡蛋的钝端打开，露出胚胎。使用解剖剪，在胚胎外侧的绒毛膜和胚外体壁上剪出四个切口，形成一个方形，确保所有切口相互连接。接着用弯头虹膜镊轻轻夹住其中一个切口的边缘，将胚胎从蛋中轻轻提起，并转移到已准备好的培养皿中。

最后，用5号镊子轻轻去除卵黄膜，然后在解剖显微镜下对胚胎进行分期。移除宿主鸡胚上的石蜡膜。接着使用 sharpened 钨针，在神经管目标区域的 VII 膜上撕开一个小孔。

向胚胎中加入一滴林格氏液。接下来，对于单侧移植（如本视频中所进行的操作），使用拉制的玻璃针小心地在神经管的中脑区域做横行的头侧和尾侧切口，切口不要超过管腔。然后在背侧神经管与侧部中胚层之间进行双侧切割。

最后，小心地将切下的外植体从神经管上分离，然后用玻璃微量移液管将其吸出，从胚胎中移除。首先，使用一个发育阶段相匹配的鹌鹑胚胎。然后，切下与刚才所示相似大小的神经管区域，并将供体外植体吸入含有林格氏液的玻璃微量移液管中。

将X外植体转移至鸡胚宿主的切除区域附近。然后使用拉制的玻璃针，轻轻调整外植体的方向，将其引导至消融区域。小心地向胚胎添加数滴林格溶液，以防止脱水。

最后，用封箱胶带密封窗口，确保胶带完全封闭窗口区域的鸡蛋，然后将鸡蛋放回培养箱中继续孵育至目标阶段。在孵育 kyira 期间，关闭摇床功能，可每天手动轻轻翻转 X 两次，以提高其存活率。若目标为较晚的发育阶段，此图为代表性图像，显示重新孵育 6 小时至 HH 11 阶段后神经管移植区域的预期结果，表明移植的鹌鹑供体组织已成功整合至宿主鸡胚的神经管中。在 HH 11 阶段对移植区域进行的横切面观察显示，神经嵴细胞经 hnk 标记后，其中一部分正从神经管向外侧迁移。

通过QCPN可清晰标记参与神经嵴细胞迁移流以及神经管的鹌鹑细胞。在后续发育阶段，可追踪鹌鹑神经嵴来源的细胞到达其最终靶组织。如本图所示，QCPN标记的细胞散布于鸡胚胎上颌突的间充质中。在E5阶段，QCPN抗体可方便地与其他抗体联合使用，以检测鹌鹑来源神经嵴细胞的分化情况。

在宿主环境中。如图所示，由鹌鹑神经嵴细胞衍生的三叉神经感觉神经元通过QCPN和TUJ1抗体进行标记。通过此方法，还可进一步开展免疫组织化学和原位杂交等其他技术，以回答更多科学问题，例如神经嵴细胞会发育形成哪些组织，以及神经嵴细胞在分化为不同组织过程中会表达哪些基因。