一种用于研究多种不同菌株的微流控装置

以下方法的总体目标是在相同的动态条件下，对不同酵母菌株的单个细胞行为进行成像。该目标通过构建一个双层微流控装置来实现：底层将分别容纳不同的菌株，而顶层则在第二步中提供动态流动条件。将不同的酵母菌株置入各孔中，然后关闭装置，从而形成一个包含多个分离菌株的单一通道。

接下来，我们通过控制 Y 型通道两个入口的流速，对细胞在动态培养基变化下的响应进行成像。结果显示，不同菌株在相同动态条件下无交叉污染，且可被独立观察。该微流控装置相较于其他现有系统具有多项关键优势，能够在相同的动态条件下对多种不同菌株进行同步成像。

此外，重要的是，该方法可在任何实验室中轻松制造，无需特殊设备。该方法的提出源于关于如何追踪不同野生东部分离株对饥饿传代响应的讨论。首先，按比例绘制或打印出所需的微通道布局。

接下来，用多层透明胶带覆盖载玻片，以达到微通道所需的高度。将设计好的布局图案放在平坦的表面上，并将载玻片对准图案放置。然后根据布局小心地在载玻片的胶带上进行裁切。最后去除载玻片上所有区域的透明胶带。

接受微通道的布局。将载玻片置于65°C的加热烘箱中三分钟。然后用乙醇轻轻清洗。

按照制造商的建议混合PDMS的基底剂和固化剂组分。将约30毫升PDMS混合物倒入培养皿中，厚度约为0.5厘米。如有需要，在真空环境中对PDMS进行脱气处理。

将玻璃载玻片浸入PDMS中，使带有图案的透明胶带面朝上。在PDMS中放置图案可防止载玻片与培养皿底部之间产生气泡。在65摄氏度下固化48小时，使用水平仪确保培养皿处于水平状态。在一个新的90毫米培养皿中倒入3毫升PDMS混合液。

如果有旋转编码器，可使用该设备完成此步骤。DGAs 及固化过程如前所述。现在用活检打孔器小心地将微流控装置的流动层切割至所需尺寸。

在流体层上为入口和出口打孔。同时从第二个培养皿中切割出尺寸相似的储液层，并将其放置在厚玻璃片上。将设计布局滑动覆盖其上。

然后使用乙醇沿布局中的微通道对齐打孔形成孔洞，清洗PDMS两层和玻璃盖玻片，并用空气干燥。接着，对玻璃盖玻片和带孔PDMS层使用标准等离子体刻蚀仪进行不可逆键合处理，或使用手持式电晕处理仪进行可逆键合处理。小心地将带孔PDMS层放置在盖玻片上方，使其粘附。

轻轻去除任何气泡。将所需培养基装入合适的注射器中，并连接到穿过注射泵的泰贡管（tigon tubing）上。用于细胞成像。

利用优势。进入所需阶段，充分涡旋混匀培养物，并将300微升转移至微量离心管中。轻轻将一微升con canna A加入PDMS微孔层的每个孔中。

在cona A干燥的同时，通过轻轻吹打水，将每个孔中过量的cona A清洗两次。用300微升不含葡萄糖的SC培养基将菌株清洗两次。从细胞壁上洗去残留的葡萄糖有助于菌株正确黏附到conval上。

涡旋振荡后，用移液器将约0.5微升的细胞悬液充分混匀后加入各个孔中。用富含营养的培养基轻轻冲洗，去除残留细胞。接下来的两个步骤需快速进行，以防止细胞干燥。

可选步骤：对芯片和孔进行等离子处理时，注意不要直接冲击孔。然后在体视显微镜下，将芯片小心地放置在孔上，密切注意两者之间的对齐情况。轻轻按压，使两层PDMS粘合。

缓慢地用约 50 微升的富集培养基完全填充装置，确保通道内无残留气泡。现在将管路插入相应的入口，连接装置，并开始培养基流动。注意避免在管路中形成气泡，因为这些气泡可能卡在装置内，破坏液体流动。

将装置置于显微镜下，找到每个样本中的合适成像位点。如有必要，让细胞在富含培养基的流动环境中保持一小时或更长时间，以促进恢复。

以恒定流速设置开始实验。将泵A设置为0.8毫升每小时，泵B设置为0.2毫升每小时。使培养基a流经通道80%的宽度。

通过改变相对流速，我们可以动态调节装置中的条件。新的条件在数秒内即可在整个通道内达到稳定。为展示不同菌株之间的分离效果，将在不同的孔中分别成像两种可区分的酵母菌株。

请注意，本实验中各孔之间无细胞泄漏。两种菌株均带有YFP标记的转录因子MSN2，用于检测动态变化条件下产生的同时效应。通过改变两个输入通道的流速，形成无葡萄糖培养基的阶跃。

这导致MSN2定位于细胞核内。重要的是，可以分析单个细胞中核内MSN2-YFP信号的时间轨迹。因此，PDMS微流控装置可用于对多个孔施加同时的动态条件。

在进行该操作时，需注意切勿使细胞在装置组装过程中干燥。一旦掌握该技术，无需软光刻即可轻松完成。