用于研究蛋白质折叠的微流控混合器

本实验的总体目标是快速混合两种溶液，以在微秒时间尺度上启动生化反应。该目标的实现首先需要制备微流控混合器；第二步是将芯片与盖玻片键合，以密封通道。

接下来，将芯片安装到含有溶液储液池的流体控制装置上。最后一步是使用共聚焦荧光显微镜对混合溶液进行成像。最终，通过将出口通道中的距离转换为时间，可在微秒时间尺度上捕捉生化反应过程。

与现有的停流混合等方法相比，该技术的主要优势在于混合不受湍流限制，且可在几微秒内完成。该方法有助于回答蛋白质折叠领域中的一些关键问题，例如疏水性塌缩何时发生？接下来，由本实验室的博士后ling woo演示微流控混合芯片的制备过程。

首先，按照本视频附带的书面方案，使用新鲜的piranha溶液清洗四英寸FU二氧化硅晶圆。接着，使用低压化学气相沉积炉，在晶圆表面沉积多晶硅涂层，每10微米深的最终微流控通道需沉积约1微米厚的涂层。随后，按照文本描述对晶圆进行进一步处理，将晶圆以旋涂法涂覆一层900纳米厚的Z 52 14光刻胶，然后在热板上直接于90摄氏度下软烘1分钟，或在110摄氏度的烘箱中烘烤30分钟。

对准光刻掩模后，首先将光刻胶暴露于紫外光下数秒，形成紧密且真空接触。随后按照书面实验方案中列出的步骤在光刻胶中显影图案。使用显微镜检查晶圆上的特征，并在热板上于115摄氏度下直接进行坚膜烘烤，持续两分钟。

接下来，使用Asher或氧气等离子体对晶圆进行DCU处理，射频功率为100瓦，处理时间为2.5分钟。使用深反应离子刻蚀器将多晶硅层完全刻蚀至下方的熔融石英。按照文中指示去除残留的光刻胶，并对晶圆进行处理。

测量蚀刻深度，以确保完全穿透聚涂层。使用能够蚀刻氧化物的深反应离子蚀刻设备，对熔融石英进行蚀刻，蚀刻深度约为每微米聚涂层厚度对应10微米。用灰化仪以100瓦射频功率清洗晶圆4分钟，并在钻孔前使用二氟化氙蚀刻剂去除多晶硅，随后在晶圆上旋涂一层新的1微米厚光刻胶，以在后续操作中保护微通道。

然后使用 Aqua Bond 55 将晶圆的功能面朝下粘附在牺牲玻璃板上。操作时需注意保持键合装置无气泡，并使用冷却的计算机控制金刚石钻头配合 Micro 90 清洁液进行清洗。这样可防止细小的玻璃碎片附着在通道上，从而避免芯片在使用过程中发生堵塞。

继续在每个芯片上钻出入口孔和出口孔。使用注射器向每个孔中注入去离子水，冲洗晶圆。然后取下照片后，在肥皂水中浸泡一小时。

按照文中所述使用抗蚀剂和粘合剂。用去离子水和温热的肥皂水冲洗晶圆。在氮气流过晶圆后，再次使用注射器冲洗每个孔，避免接触已蚀刻的结构。

继续在设定为 120 摄氏度的真空烘箱中干燥。检查孔洞是否无颗粒残留，必要时重复清洁步骤。以下步骤应在洁净室中进行。

使用光学或机械表面轮廓仪测量通道的深度。在洁净室中，按照文中所述方法清洗晶圆和熔融石英盖玻片。用氮气彻底吹干晶圆，时间不少于五分钟。

然后将晶圆有特征的一面朝上，放置在置于硬质平整表面（如一小块玻璃）上的三到四层洁净室擦拭纸上。盖玻片同样进行上述操作。用手捏住盖玻片边缘，将其翻转，使抛光面朝下对准晶圆。

对齐平面边缘，小心地将盖玻片滴落在晶圆上，并使其自然沉降，仅可水平轻推以调整对齐位置。用一根手指向下轻压晶圆中心，此时应可见结合前沿开始向外扩散。

如有需要，可对晶圆周围其他位置施加额外压力，以推进键合前沿。将密封后的晶圆置于高温烘箱中，按照文中列出的温度程序进行处理，随后使用晶圆切割锯将晶圆切割成单个芯片。用于固定混合芯片及溶液的 manifold 可由塑料（如 Lexan 或 Plexiglass）或铝制成。

为了实现温度控制，使用小型 O 型圈将芯片安装到歧管上，并用固定环固定，以确保能够清晰地光学观察芯片中心区域。O 型圈的沟槽应比标准深度更浅，以确保良好密封，同时避免对芯片施加过大的压力。芯片安装完成后，向中心和侧边的储液池中加入溶液，注意排除滞留在孔底部的任何气泡。

将多通道装置置于倒置显微镜上，并通过目镜或相机输出观察混合区域。在多通道装置上方放置一个白炽手电筒即可提供足够的照明。在中心通道中使用染料或高折射率溶液以观察射流。

由于该混合器中使用的体积非常小，因此可以通过在溶液孔上方施加气压来控制流体流动。为了观察射流情况，先将侧通道的压力设为0 psi，并缓慢增加至与中心通道压力相等。如果某一侧通道发生堵塞，射流将偏向出口通道的某一侧壁。

如果出现可见的堵塞，可通过注射器对出口通道施加压力或真空来清除。如果芯片被蛋白质或其他有机物质堵塞，可将其浸泡在食人鱼溶液中过夜进行清洗。使用二向色镜（位于显微镜内部或紧邻显微镜外部）将聚焦的激光束引入科研级显微镜中。

调整激光位置，使焦点在目镜或相机中大致位于混合区域附近可见。混合器中蛋白质的荧光被物镜收集，经二向色镜反射后，由透镜聚焦，通过针孔并成像到光子计数器上。使用压电扫描仪在 x 和 y 方向上扫描芯片，以成像混合区域。

选择射流上的一个位置，并在 X 和 Y 方向上扫描，以找到通道垂直中心处的焦点。显微镜的景深远小于通道深度，且通道内的流速是均匀的，仅在靠近壁面一微米范围内除外。因此，所观测荧光的时间分辨率主要由共聚焦光斑的尺寸决定。

沿射流方向，在出口通道内以100微米为步长进行水平扫描，每个位置观测约1毫秒。将显微镜载物台沿射流方向移动80至90微米，以捕捉更晚时间点的信号。或者，也可在二向色镜之后使用透镜将光聚焦到光谱仪的入射狭缝，通过光谱仪和CCD探测光信号。

由于数据采集速度较光子计数器慢，通常先用光子计数器对射流进行成像，然后使用光谱仪测量射流沿线的各个点。光子计数器的数据通过在每个位置对射流周围三到五个像素进行求和，生成强度随距离变化的曲线图。时间则通过距离和基于所施加压力计算出的速度来确定。

最后一步，使用文中描述的方法之一分析摄谱仪的数据。此处显示的是由光子计数器测量的混合区域光强的等高线图。喷流外部出口通道中的背景信号应接近探测器的噪声基底，通常无需扣除。

较高的背景信号可能表明对准不良，或蛋白质粘附在通道壁上。相反，如果射流出现扭曲或弯曲，尤其是在混合区域附近，则表明喷嘴刻蚀不良。图中显示了用 Alexa 488 和 Alexa 647 标记的蛋白质 ACell 辅酶 A 结合蛋白（A CBP）的时间分辨光谱。

绿色和红色矩形分别表示指定为供体和受体通道的波长。该数据已进行背景扣除，以去除暗电流和激光信号。背景信号是在中心通道压力为零磅每平方英寸时采集的。

混合时间可以通过测量一个远快于混合过程的快速反应来测定，例如碘化钾对色氨酸荧光的猝灭反应。由于射流小于显微镜的光学分辨率，混合区域会出现明显的强度下降。随着射流的形成，可通过进行对照测量（即不改变任何溶液条件）来消除该仪器响应。

本图展示了N-乙酰色氨酸酰胺荧光在混合与非混合实验中的比值。线条表示由COMSOL多物理场建模与模拟预测的碘化钾浓度。混合时间定义为浓度降低80%所需的时间，测得为八微秒。

该图显示了蛋白A CBP在变性剂浓度从六摩尔稀释至0.06摩尔后FRET信号的变化。该数据无需对照实验，因为FRET本身是一个比值，且仪器响应已被消除，因此在T等于零附近出现的快速跃变代表了在混合时间内FRET信号的迅速变化。

随着这一进展，该技术为蛋白质折叠领域的研究人员探索蛋白质结构形成的最初步骤铺平了道路。