使用一台荧光显微镜实现多种成像模式

该方法有助于解答光学显微镜领域中的关键问题，例如如何使用同一台显微镜获取超分辨率图像以及FRET图像。该技术的主要优势在于，我们可将三种不同的成像模块整合到一台显微镜中，显著降低总体成本。对该方法进行可视化演示至关重要，因为激发光路的组装过程较难掌握。

它们需要正确选择部件并进行精密的光学对准。首先，通过PCI接口安装数据采集卡，并使用该卡将激光器连接到计算机。通过晶体管-晶体管逻辑输出控制激光器的开关，通过该卡的模拟输出调节激光器的功率。

接下来，按照此处所示及随附文本方案中的描述，准备一个隔振光学平台，并安装反射镜和分束器。首先将光纤适配板安装在Z轴平移调节架上，然后在笼式平台中安装消色差双合透镜，以将激光束耦合进单模光纤。

使用延长杆连接适配器和镜头以构成一个笼式结构。然后，使用一英寸厚的光学支架将笼式结构固定在光学平台上。通过调整各组件，使647纳米激光器经光纤输出的激光功率达到最大，从而完成光路准直。

完成第一台激光器的准直后，临时安装一对小孔光阑，并逐一准直其余的激光器。使用功率计检查每台激光器的准直效率。务必在适配板前方保留一个光阑，以减少激光的反射。

接下来，按照随附的文字版实验方案设计并安装放大透镜。为了产生提取每个分子z坐标所必需的像散效应，将一个焦距为10米的3D透镜放入盒式装置中，并将其插入发射光路。为了在连续多色落射荧光成像过程中最小化振动，使用安装在显微镜旁的屏障滤光轮中的发射滤光片。

在单分子FRET实验中进行多色同时检测时，需在发射光分离器中放置另一组滤光片。若要设置基于倒置照明激发的衍射极限成像，首先在照明光路中调节激发激光的入射角度至倒置（epi）模式。接着，移出3D透镜，并将旁路立方体插入发射光分离器中。

然后，插入用于扩展照明的磁透镜。设置完成后，根据所需结果对样品进行多通道、z轴层扫和/或时间推移成像。为了建立表面固定分子的多色单分子检测，首先将滤光轮移至空位。

这将允许激光穿过。然后，调节激发激光的入射角度至与草坪角一致，并解除磁透镜和3D透镜的连接。接着，通过首先将旁路立方体更换为校准立方体（该立方体允许所有光通过所有通道），在发射分光器中启用三通道模式。

然后，在微分干涉相差（DIC）模式下打开相机，调节发射光路分光器的光圈，直到屏幕上出现三个完全分离的通道。旋转发射光路分光器上的垂直-水平调节旋钮，大致对齐这三个通道。接着，关闭相机，将校准滤光块更换为三通道滤光块。

放置100纳米多通道微球样品。在488纳米激发下，100纳米多通道微球会发射不同波长的光，从而实现三通道对齐。然后，打开相机和488纳米激光器，放大其中一个明亮的微球，并再次调节对准控制旋钮，最终完成三个通道的对齐。

样品放置就位后，使用弱激光找到一个点密度合理的区域，并调整激光功率和曝光时间，以获得可接受的信噪比和光漂白水平。然后使用成像软件采集延时图像。进行超分辨率成像时，首先插入3D镜头，并移除放大镜头。

然后确定最佳激发激光入射角作为草坪角。为了找到适用于超分辨成像的合适物镜高度，使用微分干涉差（DIC）成像定位细胞的中层平面。通过细胞变得透明时对应的高度来确定该平面。

确定所需的焦平面后，开始超分辨率成像。成像过程中，调节405纳米激光的功率，以维持合适的闪烁点密度。开始成像时，不使用紫光激光功率。

在特定时间段内统计闪烁出现的斑点数量，并增加紫色激光功率，使视野中闪烁出现的斑点数量保持在用户定义的计数阈值以上。通过检测成像帧中每个斑点的质心来分析数据，并根据X和Y方向的宽度提取每个斑点的z值。构建重建图像，并对物体进行三维可视化。

这种显微镜配置可灵活且可重复地在不同成像方法之间切换，包括传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像以及多色单分子检测。为了揭示分子组装中的更精细结构，超分辨率显微镜会整合数千张此类图像，并通过重建生成最终的超分辨率图像。

超分辨率技术能够实现高空间分辨率，提供其他技术无法观察到的细节。这一点在下方显示的两幅图像中尤为突出。超分辨率图像与落射荧光图像展示的是同一种细菌调控性核糖核酸酶，但前者可实现单分子检测。

单分子FRET（smFRET）是另一种能够实现埃至纳米级分辨率的方法。在此方法中，将折叠的RNA分子用绿色供体荧光染料和红色受体荧光染料进行标记。可以从单个单分子中提取荧光强度轨迹，从而获得随时间变化的FRET效率。

请务必注意，使用激光可能存在危险，在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴护目镜或降低激光功率。