脑片中单个神经元轴突、树突及树突棘的电压敏感染料记录

所述实验的总体目标是利用光学方法，以亚微米和亚毫秒级分辨率，从神经元多个位点对单个神经细胞的膜电位信号整合及信息处理过程进行监测。首先需构建一个具有适当灵敏度的成像系统，以记录与膜电位瞬变相对应的微弱光强变化；随后，选择具有合适形态结构的神经元，使其具有较长且完整的突起，并位于切片表面附近单一焦平面上，以实现高效成像。

然后用膜电位敏感染料加载预先选定的神经元，以实现对膜电位变化的光学追踪。结果表明，该方法具有独特的能力，可通过监测轴突、树突和树突棘的膜电位信号，获取单个神经细胞电信号整合的信息。在细胞神经生理学中。

由于传统电生理学存在两个长期局限性——电极测量的空间分辨率低，以及无法记录轴突侧支或树突棘等微小结构的信号，新的研究工具正在被开发。为克服这些缺点，可将膜片钳电极技术与光学方法相结合，从而实现对神经元所有部分进行并行记录。本文介绍了一种此类技术：以单个树突棘分辨率对膜电位瞬变进行多侧面光学记录。

本实验中，使用正置显微镜和三台相机来调节均匀照明。首先，在激光光路中插入适当的中性密度滤光片。然后，将物镜聚焦在标准荧光载玻片的表面。

在监视器屏幕上观察视场的CCD图像时，通过调节落射荧光聚光镜上的相应驱动装置，调整石英导光管接收端和输出端的位置，以实现视场内照明的居中且均匀。为测定振动噪声，使用表面带有非荧光标记的标准荧光载玻片，在神经CCD的连续模式下记录光强度。

将物镜聚焦在黑色标记的暗边缘处，并以每秒2000帧的速率记录约100毫秒的光强。然后显示来自均匀照明区域约20个像素的归一化光强轨迹的空间平均值，以及沿黑色标记边缘约20个像素的归一化光强轨迹的空间平均值。在高对比度边缘处像素的空间平均值中出现的额外噪声反映了系统的振动噪声。

必须将机械快门安装在隔振台之外，以确保快门开启时不会在光学记录中引入振动噪声。这是关键步骤。使用塑料螺钉和隔振材料安装快门，以减少光学记录系统可能接收到的声学振动噪声。

为隔离振动，调节隔振台直至覆盖图像锐利边缘的像素振动噪声小于散粒噪声。台面上的设备线缆必须保持松弛，以避免将机械振动传递至显微镜。本实验步骤中，按照标准操作制备厚度为 300 至 400 微米的脑切片，使用在特定神经元中表达 EGFP 的小鼠品系，并结合转盘共聚焦成像系统进行观察。

在切片中观察 EGFP 标记的神经元。接着，选择具有完整树突和轴突结构、且其突起与切片表面平行并靠近表面的神经元，用于膜电位成像。然后，通过施加约 15 秒的负压，从尖端开始用不含染料的细胞内液填充玻璃膜片电极，直至电极锥形部分的三分之二处。

随后，用含有膜通透性电压敏感染料的细胞内溶液回填电极。现在，在将染料装入电极后一分钟内，对预先选定的神经元进行贴附。在将移液管放入灌流槽之前，施加约10毫米汞柱的低正压，并在将电极定位至脑片过程中保持该压力，以确保在形成封接前无染料从电极中泄漏。

在电极接触细胞表面之前，将压力升高至约100毫米汞柱的高压。在全细胞记录构型下形成封接后，使荧光染料从胞体膜片电极自由扩散至胞体，持续20至45分钟。在染料扩散过程中，通过电流钳模式记录诱发的动作电位，以监测神经元的生理状态。

此外，通过以每秒两千帧的频率记录细胞胞体在中性密度滤光片调节至部分全光强下的静息光强度，来监测染色程度。持续进行下载过程，直至动作电位开始展宽。染色结束时，在电压钳制模式下小心地将膜片电极从胞体移开，以确保在此过程中实现从全细胞记录模式向外向膜片模式的转换。

然后将脑片在室温下继续孵育1.5至2小时，以使电压敏感染料扩散至神经元的突起中。当大量染料从胞体扩散至树突和轴突后，动作电位的波形应完全恢复。下一步，在低强度荧光下定位染色神经元的胞体。

使用中性密度滤光片将光照强度降低至能够观察目标结构所需的最低水平，利用XY轴载物台扫描脑片中包含荧光神经元的区域，直至识别出荧光标记的细胞体。将染色细胞的胞体置于显微镜视野中央，然后在微分干涉（DIC）模式下，用不含染料的标准膜片电极对该神经元进行封接。随后，在连续记录模式下，以每秒10至40帧的速率，在低强度荧光下观察神经元的突起结构，用于电压成像。

使用 XY 载物台位置，将成像区域中央感兴趣的神经元突起置于视野中心。此外，通过显微镜部分关闭的视场光阑来保护胞体（SOMA），以减少激发光引起的光动力损伤。接下来，记录与单个树突分支中逆向传播的动作电位相关的光学信号。

然后记录与轴突中动作电位相关的光学信号。接着，记录与树突棘中逆向传播动作电位相关的光学信号。使用适当的帧率以准确重建信号波形。

同时，应尽量缩短记录时间并减少暴露于高强度激发光的时间，以最大限度地减少染料漂白和光动力损伤。此处展示了光学信号的记录过程。上图显示了处于记录位置的染色神经元及其轴突的高分辨率共聚焦图像。

上方的图示展示了使用CCD进行膜电位成像时获得的轴突低空间分辨率荧光图像，下方图示则呈现了来自胞体的电极记录以及来自轴突起始段（A IS）和朗飞结（node of rvi）的光学记录。原始数据与处理后的信号均显示于此。该图展示了负载电压敏感染料action的L五皮层神经元轴突产生的动作电位信号。

在10千赫兹的帧率下记录了可能的相关信号。这些迹线显示了来自三个位置的动作电位瞬变。其一为从细胞体记录的电极信号。

二、轴突起始段的光学记录，以及三、来自 Vie 第一个节点的光学记录，此处为来自相同三个位置的叠加信号。该图显示了由 100 赫兹短时去极化电流脉冲在 L5 皮层神经元树突树多个位点上引发的四个逆向传播动作电位信号的簇发。此处展示的是单个树突棘的动作电位信号。

此处为从转盘共聚焦图像序列获得的解剖结构重建结果，右侧为使用CCD相机获取的同一区域的荧光图像。在膜电位成像中，右侧图显示了CCD图像中标记位置1至3处对应的后向传播动作电位的荧光强度轨迹。底部轨迹表示来自胞体的电极记录。

录制前的准备工作大约需要三小时，包括等待骰子扩散至远端过程的时间。记录时间受限于制备样本的正常衰减以及浦肯野细胞的光动力损伤。光动力损伤的程度与激发光强度、单次记录试验的持续时间及试验次数成正比。

在某些实验中，可以在一到两个小时之内完成超过 50 次的记录试验。其他测量需要高强度激发光和更长的记录时间，但由于光动力损伤的限制，仅能进行数次记录试验。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在脑切片中对单个神经元的整个轴突和末端结构进行电压成像。