通过流式细胞术检测胸腺阳性与阴性选择

以下实验的总体目标是通过流式细胞术检测小鼠胸腺的发育情况。首先从小鼠的胸腺和脾脏制备单细胞悬液。第二步，使用一组抗体混合物对胸腺细胞和脾细胞进行染色，以鉴定特定的胸腺细胞群体。

最终，可通过流式细胞术分析评估各种淋巴细胞群体的频率和数量。该方法有助于回答T细胞发育中的关键问题，例如哪些基因和信号通路对于生成具有功能且对自身细胞耐受的T细胞受体库至关重要。尽管该方法可揭示胸腺中T细胞发育的过程，也可应用于其他免疫细胞发育的研究。

通常，初次使用该方法的研究人员在设计用于流式细胞术的抗体混合物时会遇到困难。开始解剖前，将一片无菌钢网放入一个 60 × 15 毫米的培养皿中，然后向培养皿中加入 5 毫升 HBSS，并将培养皿置于冰上，以备胸腺的收集。

首先，使用一对镊子提起胸骨的下端尖部，暴露膈肌。接着，避开肝脏，剪开膈肌以分离胸廓，然后沿两侧向上剪开胸廓，注意避免损伤肺和心脏。

现在用镊子轻轻向后拉开肋骨。胸腺是位于心脏上方的白色双叶器官。用镊子的扁平边缘夹住叶状结构的底部。

然后轻轻将胸腺拉出，并放置在预先准备好的网筛之一上。为获取脾脏，需切开腹膜以暴露腹腔。脾脏呈红色，形状类似冲浪板，位于小鼠腹腔左侧，在肝脏下方。

然后使用一对镊子取出脾脏，并用另一对镊子分离结缔组织。将解剖好的脾脏置于独立的网筛上。现在使用一支3毫升注射器的推杆，在网筛上研磨每个器官，直至仅剩结缔组织和脂肪。将细胞和HBSS用移液管转移至15毫升锥形管中。

然后用新鲜的HBS缓冲液将每张滤网清洗三次。接着，在335 × g、4°C条件下离心5分钟，使细胞沉淀。在脾脏红细胞正在进行裂解的同时，吸除上清液后，将细胞重悬于500 µL CK裂解缓冲液中，在室温下孵育10分钟。

将胸腺细胞用FACS缓冲液重悬至浓度为20 × 10⁶ 个细胞/毫升，置于冰上备用。随后加入5毫升HBSS，使细胞在离心后恢复等渗状态；再次离心后，将去除红细胞的细胞沉淀用FACS缓冲液重悬至20 × 10⁶ 个细胞/毫升。此步骤起始时进行Ali Watting。

每份流式细胞术样品取4×10⁶个保留的胸腺细胞，加入至96孔板的各个孔中。接下来，将细胞加入96孔板的孔中，用于补偿对照。然后，在冰上用抗CD16/32抗体孵育10分钟，以阻断各细胞样品中的Fc受体。

现在将酶标板离心，然后将板子倒扣在水槽中轻甩一次，弃去孔中液体，再在每孔中加入200 µL封闭缓冲液重悬，重复洗涤一次。接下来，将实验样本与200 µL抗体混合液或用于补偿对照的单一荧光素标记抗体在封闭缓冲液中混合，置于冰上避光孵育。

30分钟后，用fax缓冲液洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于fax缓冲液中，将样品转移至生理性TCR转基因模型和野生型小鼠的fax管中。阳性选择始于双阳性亮期阶段，随后进入双阳性暗期阶段。在遇到抗原后，双阳性暗期胸腺细胞会先进入一个过渡性的CD4阳性CD8低表达阶段，之后成为CD4阳性细胞。

单阳性或CD8单阳性胸腺细胞成熟的单阳性胸腺细胞以其高TCR表达和CD24的丢失为特征。虽然CD8与CD4的表达谱可揭示阳性选择中的缺陷，但检测TCRβ与CD69或CD5的表达可进一步明确缺陷所在的位置。CD69和CD5均在TCR刺激后上调表达，较强的相互作用可驱动这些标志物的更高表达。

在野生型小鼠的TCR beta与CD69图中，TCRβ低、CD69阴性的门代表一群尚未经历选择的双阳性胸腺细胞。而TCRβ中等、CD69阳性的门代表T细胞受体（TCR）激活后直接产生的过渡性细胞群，主要由双阳性亮细胞组成，同时包含少量双阳性暗细胞以及CD4阳性、CD8低表达细胞。此处TCRβ高、CD69阳性的门则显示了经历阳性选择后直接产生的细胞群体，包括双阳性暗细胞、CD4阳性、CD8低表达细胞以及CD4单阳性细胞。

最后，这种TCRβ高表达、CD69阴性的表型显示出更为成熟的细胞群体，主要由CD4和CD8单阳性细胞组成。TCRβ中等表达且CD69阳性以及TCRβ高表达且CD69阳性细胞群的缺失可能提示阳性选择过程存在缺陷。在TCRβ高表达、CD69阴性群体中，CD4单阳性与CD8单阳性细胞比例的变化可能提示谱系命运决定发生改变。

TCRβ高表达CD69阳性与TCRβ高表达CD69阴性群体的减少可能反映了阳性选择后存在的存活问题。通过CD5检测TCRβ是鉴定阳性选择前和阳性选择后群体的另一种策略。前两个群体主要由双阳性亮型胸腺细胞组成。

TCR beta低表达、CD5低表达的细胞群代表未经历选择的双阳性胸腺细胞，而TCR beta中等表达、CD5中等表达的细胞群则由启动阳性选择的细胞组成。该细胞群或前述细胞群生成减少提示阳性选择缺陷。然而，TCR beta中等表达、CD5高表达的细胞群代表正处于阳性选择过程中的胸腺细胞，主要由双阳性弱表达细胞和CD4阳性细胞构成。

CD8低表达的胸腺细胞。TCRβ高表达且CD5高表达的细胞群主要由经历阳性选择后的单阳性胸腺细胞组成。CD4单阳性与CD8单阳性胸腺细胞的比例发生变化。

尽管前体细胞群正常，该细胞群中单阳性细胞的存在可能提示谱系定向发生改变。此外，该细胞群的缺失可能表明阳性选择后胸腺细胞存活减少，因为阴性选择涉及清除小部分抗原特异性细胞群。该过程中的缺陷可通过使用TCR转基因小鼠进行最佳观察，在HY CD4小鼠中，表达转基因H-Y-TCR的胸腺细胞可利用单克隆抗体T3.7进行检测。

H-Y-T-C-R 识别在 MHC I 类分子 db 中呈递的雄性特异性 HY 抗原。因此，HY CD4 雄性小鼠会发生 H-Y-T-C-R 阳性胸腺细胞的阴性选择，表现为 T3.70 阳性双阳性胸腺细胞数量减少，以及 T3.7 阳性 CD8 单阳性胸腺细胞数量更显著的下降。相比之下，HY CD4 雌性小鼠则经历阳性选择，生成 T3.7 阳性 CD8 单阳性 T 细胞。

尽管双阳性胸腺细胞数量的减少提示发生了阴性选择，但缺乏抗原特异性的单阳性胸腺细胞才是最准确的衡量指标。进一步分析HY CD4雄性小鼠中少量的T3.70阳性CD8单阳性胸腺细胞发现，其中大多数为CD24高表达的未成熟细胞。而在HY CD4雌性小鼠中，大多数T3.70阳性CD8单阳性胸腺细胞已达到成熟状态，表现为CD24低表达，这一结果进一步支持了阴性选择发生在HY CD4雄性小鼠中的结论。

TCR转基因模型的一个局限性在于，由于TCR在胸腺细胞发育全过程中的高表达，难以通过鉴定TCR、CD69或CD5的表达来进一步表征阳性选择。HY CD4雌性小鼠中存在大量T3.70阳性双阳性胸腺细胞，这些细胞经历了阳性选择。这表现为与野生型相比，CD69阳性细胞群增加。阴性选择所需的TCR刺激亲和力高于阳性选择，这一点可通过HY CD4雄性小鼠中T3.70阳性双阳性胸腺细胞上CD69的更高表达得以体现，表现为直方图峰值向右偏移。

在分析基因改造小鼠的胸腺选择时，CD5的表达也呈现出类似的趋势。通过检测CD69或CD5的表达，可以确定缺陷是源于TCR信号传导，还是TCR刺激的下游效应。一旦掌握该技术，细胞制备和染色可在两个半小时内完成，另需一小时在流式细胞仪上进行数据采集。

若操作正确，每只额外的小鼠大约增加30分钟。在尝试此操作时，重要的是要记住轻柔处理胸腺细胞，并确保事先规划好染色策略。遵循此操作步骤。

还可以进行其他检测，例如杀伤实验或细胞因子产生实验，以回答更多问题，比如输出的胸腺细胞是否功能正常。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用流式细胞术分析胸腺发育位点。