通过荧光显微镜在活体哺乳动物细胞中监测质粒在多个世代中的复制

本实验的总体目标是观察病毒基因组在分裂细胞中的分配情况。首先构建一种可通过荧光显微镜观察的质粒来实现这一目标。此处构建的质粒包含乳糖操纵子序列（LAC O）的串联重复序列。第二步是将该质粒导入正在分裂的细胞中，随后用一种编码乳糖阻遏蛋白（lac eye）与荧光蛋白融合蛋白的逆转录病毒来感染这些细胞。

乳糖阻遏蛋白融合蛋白将特异性结合质粒中的乳糖操纵序列。通过荧光显微镜监测细胞，以追踪单个质粒在多次细胞周期中的行为。最终，对获取的图像进行处理，以确定病毒基因组在分裂细胞中是如何维持的。

与现有的定量 PCR、Southern 印迹或荧光原位杂交等方法相比，该技术的主要优势在于能够对单个质粒在多个时间点进行观察。为了通过荧光显微镜可视化质粒，采用标准的分子克隆技术将一段包含约 250 个乳糖操纵子序列（lactose operator sequence）或 LAC O 拷贝的 DNA 片段插入质粒中。在本示例中，该质粒是一种大小约为 170 千碱基对的细菌人工染色体，包含卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的完整基因组，并编码对潮霉素的抗性。

通过转染法将含有质粒DNA的LAC O导入HeLa和SLK哺乳动物细胞中：在60毫米培养皿中，将细胞与10微克纯化质粒DNA、25微升Lipofectamine 2000、0.5毫升Opti-MEM以及3.5毫升DMEM共同孵育4小时。随后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养细胞48小时使其恢复。

随后将转染的细胞以低密度接种于大培养皿中，在含有10%胎牛血清和300微克/毫升潮霉素的DMEM培养基中培养三周，以筛选导入的质粒。使用无菌的吸头碎片和浸湿的滤纸片，将对潮霉素具有抗性的菌落转移至新的培养皿中。当转染的克隆经过一至两周生长至铺满培养皿时，将其置于培养箱中，分离DNA进行限制性酶切和Southern印迹分析，以确认LAC O质粒的聚合物均一且大小符合预期。此示例印迹结果显示，克隆1中的LAC O聚合物均一，并与阳性对照一致。

在第七泳道中，如果质粒未被设计为表达乳糖阻遏蛋白LacI的融合蛋白，则用编码LacI与红色荧光蛋白（如TD番茄）融合的逆转录病毒转导合适的克隆。选择TD番茄而非更接近绿色荧光的蛋白，是为了尽量减少长时间多次曝光所导致的光毒性。一旦引入LacI融合蛋白，需在含有200微克/毫升IPTG的条件下培养细胞，以阻止融合蛋白与DNA结合。该实验流程中最关键的环节之一是获得具有适当荧光强度的克隆。

应筛选大量克隆，以鉴定出具有最佳荧光表达的克隆。培养细胞至少三天，以使LAC eye TD番茄蛋白充分表达。筛选那些lac eye、TD番茄表达水平最佳的克隆，其信号清晰且未结合的融合蛋白背景信号最低。成像前24至48小时，将表达LAC I TD番茄蛋白的细胞接种于35毫米玻璃底培养皿中，密度低于10%汇合度。这样可使成对的细胞在成像开始前1至3小时内分裂形成8至16个细胞的克隆，且彼此不重叠。

用不含选择性药物和IPTG的培养基将培养板冲洗三次。此步骤可去除不可存活的细胞，并允许lac眼融合蛋白与质粒中的LAC细胞结合。在成像前1至3小时，更换培养基为2毫升含10%胎牛血清和25毫摩尔Hippies的DMEM。将35毫米培养皿的皿盖替换为固定环上拉伸的培养箔。

此盖子可抑制培养基蒸发，否则随着时间推移盐浓度会升高，导致细胞死亡。本实验所用的成像系统包括一台蔡司Axio 200 M倒置显微镜，配备电动载物台和EM CCD相机，用于高灵敏度信号检测。荧光激发光源由Collibra系统的中性白光LED提供。

成像系统由软件控制，可对多个Z轴层进行长时间间隔的自动图像采集。使用载物台顶部培养箱，在湿润环境中维持细胞处于37摄氏度、5%至10%二氧化碳条件下。使用加热套环对油镜进行加热，以防止物镜产生虹吸现象。

样品产生的热量需留出足够时间使系统达到稳定温度。为尽量减少实验过程中因移动造成的伪影，成像系统应放置在气浮台上，以隔绝振动干扰。开始可视化标记DNA的实验步骤时，先使用微分干涉差（DIC）成像观察细胞，并确定多个视野中每个细胞顶部和底部的焦平面；在每个视野中，将焦平面移至从细胞顶部向下约三分之一处，保存该位置的x、y、z坐标至已保存的载物台位置列表中。

每个保存的位置都将是显微镜控制软件中用于捕获细胞的Z轴图像序列的中心。在每个保存的载物台位置定义一个Z轴图像序列，设置足够的光学切片层数，以确保完整捕获整个细胞，并在细胞所在平面的上方和下方额外增加若干切片层。选择0.35至0.50微米的Z轴步进尺寸，以实现Z方向上接近奈奎斯特采样的分辨率。这些光学切片有助于在细胞周期中追踪细胞的运动，也用于图像堆栈采集后的处理分析。

根据细胞的厚度，这将产生40到60张图像的堆栈。设置一个时间序列实验，以30分钟为间隔采集Zacks的明场图像，并以10到60分钟为间隔采集荧光图像。实验过程中不要使用微分干涉差（DIC）成像，因为它比标准明场成像需要更多的光照，可能在长时间实验过程中使细胞过度暴露于光毒性。

启动由软件控制的实验。确保实验过程中系统不受任何干扰。在完成实验所需的所有图像采集后，查看每张Zack及每个时间点的图像，裁剪掉图像中不必要的区域，以减少计算机处理时间。

下一步是将每个Z堆栈中的信号强度重新分配至其原始像素位置。使用基于成像系统实测点扩散函数的Axio Vision软件中的去卷积算法。此处显示了去卷积的结果。

观察图像以追踪质粒在细胞周期中的强度变化和运动，以及质粒向子细胞的分配情况。这些图像通过计算方法生成，包含多个Z平面，不同信号位于不同的Z平面中。图像显示，表达LAC眼TD番茄荧光蛋白的HELOC细胞核因融合蛋白上的核定位信号而呈现荧光，该信号使蛋白定位于细胞核内。在没有I-P-T-G-K-S-H-V基因组的情况下，编码LAC O序列的基因组会招募大量荧光蛋白拷贝，因而在细胞核背景强度之上呈现出明亮的信号。

相比之下，在存在IPTG的情况下，LAC阻遏蛋白无法与其识别序列lac O结合，该图展示了一次代表性实验中，在五个时间点对一个完整细胞周期的Zack细胞进行成像所获得的最大强度投影结果。荧光标记的病毒基因组在A图中可见，其合成过程如B图所示。随后，在细胞分裂过程中，病毒基因组被分配至子代细胞，如C、D和E图所示。健康HELOC细胞的细胞周期大约持续24小时，子代细胞通常彼此靠近贴附，并在下一个细胞周期中同时进行分裂。

通过本方案，可在多次传代过程中追踪细胞内的病毒基因组。在进行该实验时，重要的是要留意细胞在传代过程中的形态变化，以确保细胞在整个实验期间保持健康状态。