利用气相色谱-多通道记录技术（GCMR）鉴定昆虫触角叶中的嗅觉挥发物

本实验的总体目标是通过记录大黄蜂脑部的神经活动，从复杂的气味混合物中鉴定出具有生物活性的气味分子。该目标的实现分为三个步骤：首先，收集具有行为学效应的气味物质；其次，为实验准备气相色谱仪和多通道记录系统；第三步，准备并解剖大黄蜂脑组织，以便对触角叶的神经活动进行记录。

然后通过将电极插入天线叶中，并通过分析神经活动对复杂气味及其各组分的反应来测量挥发物的响应，从而进行实验。可通过气相色谱法鉴定获得具有生物活性的气味物质。因此，该技术相较于其他技术（如 G-C-E-A-G）的主要优势在于天线叶神经元的敏感性，以及能够表征大脑神经元对特定花香挥发物的响应方式。

该方法的可视化演示至关重要，因为结合电生理学和化学分析的步骤较难掌握，涉及电生理记录技术以及采集顶空气体挥发物的必要操作。尽管该技术可为了解熊蜂的嗅觉信息处理提供见解，但也同样适用于其他系统，例如蚊子或锥蝽等传播疾病的媒介昆虫，或蚜虫、蛾类等农业害虫。在进行本实验前，需准备一根固定在显微操作器上的钨丝制成的参考电极。

微型操作器配备有多通道电极，例如连接到前置放大器的盘绕导线、微丝电极或硅基多通道电极，并通过屏蔽BNC接口连接至气相色谱仪。气相色谱仪检测器的输出信号与放大器及数据采集系统相连接，从而使神经信号与气相色谱信号实现同步。在此示例中，气相色谱仪的载气为氦气，使用的是DB-5型气相色谱柱。

气相色谱仪采用分流进样口，温度设定为 200 摄氏度，火焰离子化检测器温度设定为 230 摄氏度。样品在气相色谱中加热后，色谱柱流出物通过玻璃 Y 型连接器等比例分流至火焰离子化检测器和 B 天线。本示例中，气相色谱用于输送通过动态吸收法从加州原生高山野花 Mimus Lewis eye 花朵中收集的挥发性物质。

或者，不使用气相色谱，而是通过气流脉冲递送单一挥发性化合物或化合物混合物。将含有已沉积化合物的滤纸片置于独立的玻璃注射器中，并通过气流脉冲将其吹出。气流脉冲由计算机控制的电磁阀从恒定气流中分流产生。

从1毫升移液枪头的末端切下约一厘米开始准备。将一只熊蜂放入移液枪头的底部，轻轻将其推向枪头的另一端，直至仅头部露出。使用融化的牙科蜡，在暴露的头部周围制作一个模具。

石蜡必须粘附在复眼上以完全固定头部，但必要时不得接触触角。使用细小的针固定触角。接着，使用锋利的刀片（如显微解剖刀）在头壳上切出一个方形窗口状的切口。

从触角后方紧邻复眼处开始剪开。在两眼之间剪一条直线。接着，沿背侧方向剪开，直至头部囊壳弯曲至胸部。

继续切割至头壳的另一端。最后，返回起点完成方形切口。用镊子移除切下的表皮。

必须去除紧邻触角的角质层，否则一旦暴露脑组织，该结构将阻碍电极插入。立即用昆虫生理盐水灌注组织。确保触角叶充分暴露。

然后使用一对非常精细的镊子小心地移除触角叶上方的神经外膜。务必小心，避免镊子刺破蜜蜂的大脑。此时蜜蜂标本已准备好进行电生理记录。

首先将准备好的蜜蜂固定在连接于磁性底座的夹子上。通过带有流量控制器的储液装置持续灌注昆虫生理盐水，以保持其处于超灌流状态。随后将参考电极插入对侧脑组织中。

接下来，将多通道电极插入蜜蜂的触角叶中。电极就位后，等待30至60分钟，使记录信号稳定。

在此期间，通过设定阈值开始准备记录神经元的细胞外峰电位。由于记录通道中存在噪声，部分通道可能需要手动设定阈值。接下来，验证气相色谱运行的温度梯度是否正确。

在此示例中，温度起始于 50 摄氏度并维持四分钟，随后以每分钟升高 10 摄氏度的速率升至最终温度 220 摄氏度，或在此温度下保持六分钟。当记录通道中各单元的波形形态趋于一致时，认为神经记录已达到稳定状态。一旦稳定，用花香顶空气体装填注射器，并将该气体注入气相色谱仪的进样口。

气相色谱运行结束后，立即开始记录电极信号。让制备样品静置5至15分钟。然后向气相色谱仪注入另一个样品，或使用单一挥发性化合物或化合物混合物刺激样品。

如果在任何时候自发活动突然停止或发生变化，请检查灌流液滴注情况，并让标本休息15分钟。如果活动未能恢复至先前水平，则弃用该标本。实验结束后，将探针保留在组织中，固定脑组织，然后取出脑组织，清除固定液并进行脱水处理。

然后可以通过共聚焦显微镜从迷梦花（Mimus Luci）的花香中确定记录通道的位置。挥发性物质的总数正在被分析。气相色谱通常可检测到60至70种化合物。

密茉莉（Mimus Luci）的气味主要由单萜类化合物组成，包括β-肌球蛋白（beta myosin）和α-蒎烯（alpha pinine）。其余气味成分则由六碳挥发物构成。若干样品用三微升（3 µL）的密茉莉提取物进行刺激处理。

这个记录来自多通道电极记录的八个神经单元之一，展示了神经元对特定挥发性物质的选择性反应。在此示例中，所显示的化合物为二烯。以下是八个神经单元的反应情况。

大约一半的神经元集群无反应。考虑到花香头部空间所提及的挥发性化合物具有多样性，这一结果令人意外，但该现象在不同制备样本中具有一致性，且已被其他研究报道。对有反应神经元单元的标准化放电频率显示，这些单元对某一类气味分子具有强烈的选择性。

箭头所指示的气味物质引发了最强烈的反应，它们分别是二甲基硫醚和反式β罗勒烯。通过观看本视频，您应该能够充分理解如何准备实验用昆虫，并掌握使用气相色谱结合多通道记录技术开展实验的方法。

接下来的目标是从复杂的气味混合物中鉴定出可能具有行为效应的气味物质。一旦掌握，若按照本方案正确操作，该技术可在两到三个小时内完成。此外，还可对已鉴定出的气味物质进行行为学测试等其他方法，以全面确定这些挥发性物质在介导昆虫行为反应中的有效性。