使用3DNA分析与构建核酸结构

本实验的总体目标是将 3D NA 系列程序提供给实验室科研人员及其他相关人员，以利用先进的计算工具研究 DNA 和 RNA 的空间结构。首先需从 3D NA 论坛下载该软件，并将其安装至本地计算机；第二步是分析一个具有代表性的 DNA 结构，其分析水平深入到构成该结构的碱基对步长。

接下来，在碱基对步长水平上对该相同的DNA结构进行修饰，并利用新定义的碱基对步长参数重新构建该结构。随后的步骤是对一组相关的结构集合进行分析。最后一步是将一组相关的DNA结构在统一的参考坐标系中进行比对，以可视化这些结构的整体形变。

最终，3D NA 工具可用于研究单个碱基对步幅（包括与药物和蛋白质结合的碱基对步幅）如何影响 DNA 的整体折叠结构，并识别显著全局畸变的发生位点及其方向。该技术相较于现有方法的主要优势在于其软件具有高度稳健性，并可广泛适用于多种不同的含核酸结构。该方法有助于回答生物化学与生物物理学中的关键问题，例如基因组在三维空间中如何组织，以及 DNA 可以发生何种类型的形变。

要开始安装软件包，请访问三DA网站@xthreed.org，并点击论坛中的3D NA论坛链接。在论坛内，选择注册链接，然后按照说明创建一个新账户。

在建立用户名和密码后，登录论坛，在欢迎部分选择“下载”链接，然后在新页面中选择 3D NA 下载。双击 tar gz 文件以创建一个名为 X 3D NA dash V 2.1 的文件夹，该文件夹包含 3D NA 软件。打开终端应用程序（通常位于 Macintosh 系统的“实用工具”下），并切换至 X 3D NA dash V 2.1 目录。

运行使 3D NA 正常运行所需设置脚本。本视频中使用的所有命令均可在文字版实验方案中找到。接下来，复制屏幕上显示的两行导出设置。

如果用户已将软件放置在应用程序目录中，则应显示如下两行内容。打开位于应用程序目录中的文本编辑应用程序，在格式菜单下选择“设为纯文本”。

如果存在 BRC 文件，请在文本编辑器中打开该文件，编辑并将其末尾添加导出设置。如果不存在 bash RC 文件，请将导出设置粘贴到一个空白文件中，并将该文件保存为位于主目录中的文件名 bash RC。为了使新设置生效，需在终端程序中运行新保存的 Bash RC 文件。

本视频演示了对一种代表性核酸结构的分析，即与来自伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）的 HBB 蛋白结合的 DNA 结构。三维核酸（3D NA）分析的第一步是创建一个列出所有配对碱基的文件。这一步通过输入命令，将 FindPair 程序应用于存储在文件 np2.mp2.pdb 中的原子结构来完成。

分析的下一步是确定表征该结构的几何参数。analyze 命令以碱基对文件作为输入，并在工作目录中生成多个输出文件。随后，通过输入命令“analyze two MP two bps”即可计算几何参数。

生成的输出文件包含两个 MP2 输出文件（two MP two out），其中包含计算参数的概览，以及 bpco_step_par 文件，其中包含刚体参数列表。除了分析核酸结构外，3D NA 软件还提供根据刚体参数构建结构模型的功能，可通过使用 rebuild 命令生成包含骨架原子和碱基原子坐标的近似原子模型。输入文本中列出的命令。该命令指示 3D NA 在从刚体参数构建模型时引入标准 B 型 DNA 骨架构象。

随后可通过输入相应命令，构建具有 H-B-B-D-N-A 结构中发现的刚体参数的双螺旋模型。可以编辑 bpco 步骤参数文件以生成修饰后的结构。在此，对弯曲程度最大两个位点处形成的极端 roll 角度进行了修饰。

然后以修改后的步骤参数集合作为输入文件来构建结构。这两个模型可以使用标准的分子查看器进行观察，从而与单个核酸结构的分析形成对比。本视频部分将展示如何分析一组文件中的大量结构集合，这些文件名以 MD_ set one PDB 开头，并以数字结尾。

分析的第一步是鉴定通过运行 find pair 程序获得的配对碱基，方法与之前相同。由于整个结构集合共享相同的碱基配对方案，因此只需在此处的一个代表性文件（以 1001 结尾的文件）上运行一次 find pair。这将生成碱基配对信息，并将其存储在文件 MD at set one BPS PS 中。下一步是使用命令 X3D ncore ensemble.Analyze 来确定整个结构集合的几何参数。然后可从总览输出文件 MD at set one out 中提取所需的刚体参数。

使用 Command X 三重 DCO 集成提取工具进行此操作。提取出横滚角，并生成横滚角的逗号分隔文本文件。该文件可导入其他程序中以进行进一步分析和绘图。

最新版本的3D NA新增了一项功能，允许用户从一个共同的视角观察多个结构。X三重DCO系综重定向命令会将一组相关结构叠加到一个共同的碱基对或碱基对步上，如同之前的方案所述。第一步是使用find pair程序计算DNA的碱基配对。

在此情况下，输入文件是两个 KEK pdb 文件，其中包含 CIA coli、O 3D NA 操纵子与 LAC 阻遏蛋白头部结构域结合的 10 个结构。命令 X three DCO 系综重定向将对多模型结构中的各个模型进行比对，使其处于统一的参考坐标系中。该命令需要前一步骤生成的 PDB 文件和碱基配对文件作为输入。

命令中还包含所有结构进行比对所依据的碱基对步序信息。W 3D NA 网络界面包含了 3D NA 软件包的一些常用功能。本视频的这一部分重点展示了利用该网络服务器构建蛋白质修饰 DNA 的三维模型的能力。

构建蛋白质修饰的DNA模型的第一步是访问位于 w three d.rutgers.edu 的 W 3D NA 网站。在页面左上角的菜单中选择“重建”选项，即可激活在线建模功能。下一步是在新页面中部浅色框内找到并选择“结合蛋白-DNA模板”链接。

此选择将激活一个下拉菜单，允许用户指定结合蛋白的数量。选择结合蛋白的数量后，将进入一个新的参数设置页面。用户随后可输入或粘贴目标序列。

在新页面中间的文本框下方，有一个下拉菜单，用于选择DNA未结合区域的螺旋构象。在规格页面底部附近有一个文本框，用于输入结合蛋白的结合位置和文件名。结合位置指定了蛋白质结合片段中心在DNA序列上的位置。

在规格页面底部，有一个选项框允许用户生成蛋白质结合DNA的预览图。在此情况下，勾选该选项框并点击继续按钮。此操作将生成一个审阅页面，列出所选参数以及因所选结合位点重叠可能产生的任何错误。

如果需要进行任何修改，用户可选择返回按钮，或选择构建按钮继续操作。下一页将显示DNA-蛋白质复合物在最伸展构象下的静态图像，并支持通过网络进行在线交互式可视化。用户还可以下载包含原子坐标的文件。

3D NA 软件工具通常用于分析核酸结构。刚体参数的数值揭示了三维结构中的畸变，例如在第13步和第22步处发现的DNA向大沟方向剧烈弯曲的两个位点，其卷曲角呈较大的正值。该结果来自DNA与伯氏疏螺旋体RHBB蛋白的晶体复合物。

该软件能够利用这些参数重建结构，从而确定各个碱基和碱基对步进如何影响整个分子的折叠构象。如图所示，HBB 引起的 DNA 全局弯曲不仅仅反映上述两种极端的螺旋扭曲。即使将这些碱基对步进拉直后重建，DNA 仍保持高度弯曲。

此时，该角色的两个最大值已被设为零。3D NA 中新近增强的功能可对大量相关结构进行分析，从而能够提取模拟 DNA 和 RNA 分子空间排列中与序列和时间相关的模式。例如，对两组大规模模拟 DNA 结构中相邻碱基对之间的螺旋角进行黄色着色显示，这些分子在嘧啶-嘌呤碱基对步骤处存在优先弯曲的趋势。

在DNA末端短暂持续出现的红色高值表示局部熔解和双螺旋结构的重新弯曲。其他刚体参数（如互补碱基之间的角度和距离）的变化模式有助于解析精确的结构畸变。3D NA软件能够将相关分子重新定向至一个共同的参考坐标系，从而揭示出隐藏在蛋白质数据库中许多文件中的整体结构特征。

例如，基于对应原子的均方根拟合对相关结构进行传统叠合时，会产生一系列在此处大致相互重叠的相似空间路径；然而，当将大肠杆菌（Escherichia coli）O3 DNA 操纵子与乳糖阻遏蛋白头部结构域结合的10个基于NMR的模型，共同叠合到每条双链五端末端碱基对的同一坐标系上时，会暴露出明显的整体结构畸变，其中分子朝显著不同的方向发生弯曲。这种结构多样性可能影响大肠杆菌乳糖阻遏蛋白结合O3位点并诱导O3与序列上距离较远的其他操纵子之间形成环状结构的难易程度。如图所示，像来自伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）的建筑蛋白HBB这类蛋白质在DNA上的精确定位，可能对DNA的整体折叠构象产生显著影响。

若两个已知高分辨率结构的拷贝相距43个碱基对，则一段81个碱基对的DNA片段会闭合形成紧密的近似环状构型。若两个蛋白质之间的间距增加五个碱基对，DNA则呈现开放的蜿蜒路径。蛋白质修饰的双链DNA所展现出的截然不同的排列方式，说明了结构蛋白的间距如何影响DNA在形成后的环化或成环过程。

该技术为核酸结构生物学领域的研究人员探索DNA-蛋白质相互作用、RNA折叠以及纳米颗粒设计铺平了道路，有助于更深入地理解发育缺陷和癌症等疾病，并推动新型治疗手段的设计。