同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

本实验的总体目标是在固定或活细胞中同时以纳米级精度对多种蛋白质进行成像。首先，通过调整相机和光学元件的位置，使显微镜产生的清晰图像投射到相机芯片上；第二步是调整激光束，使其直接对准显微镜载物台上的样品。

接下来，对制备好的细胞样品进行照明，并选择表达目标蛋白的细胞。最后一步是利用荧光光激活定位显微镜对细胞成像：通过激光照射样品，将细胞发出的荧光引导至相机芯片以获取数据集。最终，荧光光激活定位显微镜可用于在固定或活细胞中，以纳米级空间分辨率显示多种蛋白质在宽场成像或利用全内反射荧光技术限定样品薄层区域时的定位分布。

与共聚焦显微镜或电子显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于，可在固定或活细胞中以纳米级分辨率同时对多种蛋白质进行成像。以下步骤参照此处所示的编号系统，该编号系统为随附文本方案中图一提供的多色F Om装置示意图。首先，将校准标尺或刻度片置于显微镜载物台上，使用10倍物镜，并将光源设置为透射光模式，然后将垂直刻度线置于视野中央。

接下来，通过闭合视场光阑并从目镜观察垂直方向，调整显微镜以实现同轴照明。如果视场光阑的边缘失焦，请调节聚光镜的高度，直至视场光阑和分划板均清晰聚焦。然后调节视场光阑的横向位置，使其相对于视场居中，并逐渐闭合视场光阑，直到仅分划板中央的网格被照亮为止。

首次组装这些组件时，应调节各通道的光路长度使其相等。为完成此操作，将红光反射至相机芯片，调节第七和第九个反射镜，并关闭检测光阑以防止两个通道之间的空间重叠。然后聚焦反射光通道中自由基的图像，并检查其在透射光通道中是否也处于聚焦状态。

如果透射光通道中的图像未对焦，请平移第九个反射镜，直至两个通道中的自由基图像同时对焦。开始对激光进行准直时，先将第一个透镜从激光光路中移除，并遮挡激活光束和读出光束。然后将一张白卡紧贴第四反射镜，打开显微镜快门并进行对焦，直到自由基图像投射到第四反射镜前方的白卡上。

接下来，解除读出光束的遮挡，调节第一面反射镜，使读出激光对准第四面反射镜上自由基图像十字线的中心。对准后，将自由基图像投射到第五面反射镜上，并调节第四面反射镜，直至光束对准第五面反射镜图像十字线的中心。此时，读出光束应在M4和M5处均处于中心位置。

然后通过关闭快门一来阻断读出光束。接着，将自由基图像投射到镜三上。从激光光路中移除扩束器，并解除对激活激光的阻断。

现在调整镜片二，使激活光束对准镜片三上自由基图像的十字准线中心。对准后，在镜片二和镜片三之间重新安装扩束镜，并调节扩束镜的位置，直至光束在镜片三的自由基图像十字准线上居中。在镜片三上，将自由基图像投射到镜片五并进行聚焦。

使用显微镜的调焦旋钮，调节第一块二向色镜的角度，直至激发光束位于红色图像的中心。然后在无物镜且显微镜快门打开的情况下，关闭快门二以阻断激发激光。打开读出快门（快门一），并将激光通过显微镜的后孔径投射出去。

调节第五个反射镜，直至光束从显微镜中射出，使光束在物镜和透镜一复位的情况下垂直离开显微镜。将含有100 µM溴素B的样品置于载物台上，并阻断激发激光。通过60倍物镜将读出激光投射到染料中。

关闭电子倍增增益。将此图像发送至相机。接下来，将物镜聚焦到样品中。

将光圈开得足够大，以允许对整个光束轮廓进行成像。然后横向移动光圈，使光束轮廓的中心与光圈中心重合。使用相机软件选择感兴趣区域，设置最小的相机读出区域以同时包含两个通道，并记录这些坐标。

此时，记录单张图像以表示读出光束的光斑轮廓。接下来，通过关闭快门一来阻断读出激光，并打开快门二。为了开始测量激活光束的光斑轮廓，将激活激光投射到样品上；如有必要，使用低于100的电子倍增增益，并调节第一块二向色镜，直至光束在每个视野中居中。

然后记录激活光束轮廓的快照，以开始采集多色 f-PALM 图像。消除所有室内照明。接着通过翻转镜将汞灯投射到转染的细胞上，并将滤光片转轮更换为包含预光转换状态适当激发波长的滤光片组。

选定细胞后，将翻转支架下调，使激光能够进入显微镜，并根据配套文本方案中的描述，将滤光片转盘切换至含有适用于成像的二向色镜的滤光片位。随后将图像投射到相机上，以区分转染细胞与背景荧光，并确认分子可被光激活。使用激活激光以低于10微瓦的低功率短暂照射样品。

接下来，通过将电子倍增增益设为200，并将所需帧数设为5至10,000之间，准备相机软件以进行动力学序列采集。同时将曝光时间设为10至30毫秒之间。然后阻断激活光束，解除读出光束的阻断，并将被照射细胞的图像投射到相机上。

通过向下调节焦距，直至单个分子不再可见，选择靠近底部细胞膜的一个焦平面。然后逐渐向上移动焦距，直到分子首次可见。此时解除激活光束的阻断，以低于每平方厘米1瓦的强度照射样品。

通过相机软件开始采集这些数据，同时通过动态调节激发激光前的中性密度滤光片，保持每平方微米有 0.1 至一个可见的可成像分子。对于全内反射荧光成像，将镜片五和透镜一安装在同一个平移台上，置于显微镜入口后方稍靠侧向的位置。当移动镜片五和透镜一时，激光会通过样品从物镜向上射出，并逐渐向一侧倾斜；持续平移该平移台，直至激光与垂直方向成 90 度角。

此时，产生的激光本身将消失，入射激光会被反射回孔径，沿与入射光束反平行的方向传播，并向侧向偏移。当样品进入全内反射荧光状态时，背景信号应有所降低。图像采集完成后，立即关闭显微镜快门并阻断两束激光。关闭电子倍增增益。

将相机设置为录制单帧，并将相机的读出区域设为最大尺寸。最后，通过在显微镜光源上安装长通滤光片，并用卡片遮挡 F3 或 F4 通道来阻断其中一个通道。照射样品，并将此图像投射到相机上。

在透射光下拍摄细胞的快照，以代表整个细胞。图中显示的是表达 DENDRA two Hemagglutinin 和 PAM Cherry actin 的 NIH three T three 细胞的双色 F palm 采集示例。左侧的透射通道包含比右侧反射通道更长的波长。

此处显示的是在完成背景扣除并进行变换以叠加左右两个通道后，同一双色荧光显微图像采集的快照。可以识别并定位单个分子。某些分子在透射通道中显得更亮，而另一些分子在两个通道间的发射光分布更为均匀。

这表明了PAM cherry与DENDRA2之间发射光谱的差异，并用于分析以区分这两种分子。此处显示的直方图表示在应用容差后，所有定位分子的红色透射通道强度与总强度的比值。在左下图像中，像素显示为白色；在右下所示的最终合并图像中，这些像素显示为红色。而位于绿色区域的像素在右上图像中显示为白色，在右下所示的最终合并图像中显示为绿色。

在进行图像渲染时，所选择的阈值水平会极大地影响噪声程度以及共定位的显现效果。此处展示了三种不同的渲染选项，其产生的荧光渗漏程度各不相同，其中最为保守的阈值水平显示在下方两图中。当图像中存在两个可区分的峰时，通过颜色F palm alpha直方图进行解读最为合适。

尽管左侧的直方图适合进行进一步分析，但根据此方法，由另外两个直方图得到的图像将更难以解释。可以采用全内反射显微技术、显微成像以及活细胞成像等方法，以回答诸如蛋白质在活细胞膜中的纳米尺度上如何组织等其他科学问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何搭建自己的FAR显微镜，并利用它来获取数据。

请勿忘记，使用激光器可能具有极高的危险性，在尝试此操作之前必须完成安全培训。