使用甲基转移酶和辅因子类似物对核酸和蛋白质进行序列特异性标记

以下实验的总体目标是利用甲基转移酶特异性地标记DNA和蛋白质。甲基转移酶天然能够将活化的甲基以及名为S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine）的辅因子转移至DNA、RNA、蛋白质或小分子生物分子上。通过用合成的炔基辅因子替代天然辅因子S-腺苷甲硫氨酸，可实现一步标记，从而改变反应进程，使整个辅因子被酶偶联到目标分子上，进而实现底物序列的共价标记。DNA的特异性甲基转移酶标记以腺嘌呤特异性的DNA甲基转移酶M.BseCI为例进行演示，该酶可将生物素标记的炔基辅因子6-BAz共价连接至AGCGAT识别序列，实现序列特异性的生物素化DNA标记。甲基转移酶介导的活化基团转移也可用于蛋白质标记，本文以MTA70为例进行演示，该酶可将C8-炔基-S-腺苷甲硫氨酸中的丙炔基团转移至组蛋白H3的第4位赖氨酸（Lys4）上。

通过铜催化的点击化学反应，使用经叠氮修饰的荧光染料对烷基化的赖氨酸残基进行化学标记，从而实现对蛋白质的特异性标记。使用甲基转移酶进行标记的一个优势在于，其能够直接靶向天然底物。我将通过序列特异性的生物素标记质粒DNA甲基转移酶，利用辅因子类似物锌催化蛋白质修饰，证明这一方法可在两步反应中引入多种多样的报告基团。

我将通过荧光标记组蛋白 H3 并展示用生物素标记 H3 的结果来演示这一点。此外，通过将 S-腺苷-L-高半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine）这一甲基转移后的辅因子产物与多种活化醇反应，可轻松合成双活化辅因子类似物。这些合成的辅因子类似物采用反相高效液相色谱（HPLC）进行纯化，在某些情况下甚至可以分离硫原子上的差向异构体。

微笑DNA是一种序列特异性的DNA甲基转移酶诱导标记技术。本文通过使用六种BAZ Aine辅因子以及腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶对PB 3 22质粒DNA进行标记，展示了该技术的概念。M-B-S-E-C实验首先在20摄氏度下孵育六种BAZ。

修复反应混合物时，先将其置于冰上。该混合物包含1微克质粒、60微摩尔的六种BAZ，以及10当量的M-B-S-E-C一。在修饰缓冲液中，HER识别序列位于DNA上。

务必最后添加六个 BAZ 和 M-B-S-E-C。确保所使用的甲基转移酶没有结合 AME，因为天然辅因子会阻碍标记。进行反应以作为对照。

用清水替代 MTA，以观察是否存在非特异性的辅因子修饰，并在酶浓缩液中加入清水以检测其是否含有天然辅因子。随后，用移液器轻轻混匀反应体系，并在 55 摄氏度下孵育 1 小时。接近孵育结束时，将 10 微升 10 倍重组 tach 1 缓冲液加入 80 微升水中，在冰上配制内切核酸酶混合液，然后加入 3.3 微升重组 tak 1 限制性内切核酸酶。

孵育结束后，短暂离心收集反应液，然后逐一验证每个样品的DNA修饰情况。加入2 µL的10×TAK缓冲液和28 µL的内切酶混合液。用移液器轻柔吹打混匀反应体系。

现在将反应物在65摄氏度下孵育30分钟。反应完成后，短暂离心收集溶液，并将25微升反应液转移至新的离心管中。向这些等分试样中加入2.4微升经缓冲液配制的strep-TTR，其浓度为每摩尔链霉亲和素单体含1毫摩尔。

现在将该反应在 37 摄氏度下孵育一小时。孵育结束后，向完成的反应体系中加入 5 µL 6× 上样缓冲液，并将 10 µL 样品在 80 伏电压下于 1% 琼脂糖凝胶中电泳约一小时。然后观察条带，mt A 是甲基转移酶介导的活化基团转移的缩写。

在此实验中，使用甲基转移酶SET7/9以及活化的辅因子C8-Oin来标记组蛋白H3的赖氨酸4位点。将各组分在冰上解冻后，配制20微升的反应体系：反应液中包含修饰缓冲液、10微摩尔的组蛋白H3，最后加入10微摩尔的甲基转移酶和600微摩尔的辅因子。

通过用去离子水替代C eight ON来制备酶对照。同时设置辅因子对照，加入60毫摩尔的ADO met以与合成辅因子竞争，从而观察非特异性修饰。现在用移液器缓慢吹打混合反应体系，并用pH试纸检测其pH值。双活化辅因子类似物在C条件下保存。

因此，如有必要，可通过添加辅因子和少量 50 毫摩尔的氢氧化钠来调节反应溶液的 pH 值。现在将反应物在 37 摄氏度下孵育两小时，在孵育修复期间结束前，制备 20 微升含 3 毫摩尔硫酸铜、3 毫摩尔 T-H-P-T-A 配体、250 毫摩尔醋酸钠和 6 毫摩尔叠氮化物的 5× 点击反应混合液，用于 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。

孵育结束后，向每个反应体系中加入 5 µL 点击反应混合液，并通过轻弹管壁缓慢混匀反应液。用铝箔包裹反应管以避光，于 20 °C 孵育 1 小时。孵育 1 小时后，通过沉淀蛋白质去除多余的氯仿。

向每个反应体系中加入 75 微升甲醇、18.7 微升氯仿和 50 微升水，每次加入后短暂涡旋混匀。每支离心管配制完成后，在 16,000 G 离心 5 分钟。移除上层分离相时注意不要扰动界面层，界面层中含有蛋白质。

现在加入56.3 µL甲醇，与下层相混合并涡旋振荡。接着离心以沉淀蛋白质，并弃去上清液。然后加入56.3 µL甲醇。

再次涡旋振荡。重复离心并收集沉淀。将沉淀置于离心管中，不盖盖子并用无绒纸覆盖，使其自然干燥。

随后将蛋白质溶于20 µL含上样染料的SDS上样缓冲液中。用缓冲液冲洗管壁以收集沉淀。然后在95 °C下孵育试管10分钟。

待离心管恢复至室温后，短暂离心以收集管内液体，并通过SDS-PAGE分离蛋白质。以120伏电压电泳约90分钟。甲基化反应使用DNA甲基转移酶M-B-S-E-C1进行，该酶可修饰双链A-T-C-G-A-T序列中的第二个腺嘌呤残基，且在pBR322质粒上具有一个识别位点，该位点在测试质粒标记时以红色标出。

PB 3 2 2 被重组限制性内切酶T1挑战，该酶在PB 3 22上有七个识别位点（以绿色标记），其中一个位于M-B-S-E-C 1位点内。当发生标记时，该位点应在凝胶中受到保护而不被切割。此结果已得到证实。

出现了一个新的683个碱基对的片段，表明M-B-S-E-C单一位点存在标记。该片段仅在第三泳道的检测泳道中可见。通过电泳迁移率偏移实验验证了标记反应的特异性。

加入链霉亲和素后，用生物素标记的683个碱基对片段的电泳迁移率受到抑制。而缺乏M-B-S-E-C单一位点的片段迁移率保持不变，或通过双活化的八碳甲硫氨酸类似物对甲基转移酶底物进行两步标记。实验使用了组蛋白H3赖氨酸4甲基转移酶SET7/9以及小分子C8 ON辅因子。

凝胶电泳仅用于检测分析泳道中的荧光。第一泳道显示了一条对应于组蛋白H3的荧光条带，表明辅因子的侧链被特异性转移，且修饰后的蛋白质已标记上Tamara Flora.Four。ESI染色作为上样对照。

所有泳道显示的蛋白量相同。甲基转移酶底物也可通过叠氮衍生的生物素进行生物素标记反应。以辣根过氧化物酶进行的 Western 印迹检测替代了荧光检测。

结合腺体后，在观看此视频后观察到成功且特异性的标记。您应充分理解如何对DNA和蛋白质序列进行标记，特别是使用亲和标签、荧光染料或其他标记物进行标记。在进行该实验操作时，重要的是要记住，其他甲硫氨酸及其类似物对温度敏感。

始终在冰上操作，并在零下20摄氏度保存。我合成了双活化的其他MET类似物，其报告基团已构建在侧链中，并利用它们一步特异性标记DNA。

我尤其对利用单分子技术将不同的酶和报告基团组合用于DNA作图的前景感到兴奋。Smiling和NEC具有高度灵活性，几乎任何化学基团都可以通过适当的甲基转移酶，不仅转移到DNA和蛋白质上，还可以转移到RNA和小分子上。