从感染Plasmodium berghei ANKA小鼠中分离和分析脑滞留白细胞

本实验的总体目标是从感染疟原虫（plasmodium burge eye anca）并诱发实验性脑疟疾的小鼠脑血管中分离出黏附的炎症性白细胞。通过注射感染疟原虫（plasmodium berge eye anca）寄生的红细胞使小鼠感染。当小鼠开始出现疾病症状后，采用经口灌注法清除疟疾感染小鼠体内的循环细胞。

随后收获脑组织，并用酶消化组织以分离出炎性白细胞。接着进行多色流式细胞术以进行免疫表型分析。对脑内滞留的白细胞进行数据分析，可揭示迁移至疟疾感染小鼠脑内的白细胞百分比及绝对数量。

该方法有助于回答疟疾发病机制领域中的关键问题，例如在不同实验条件下，哪些类型的炎性细胞会迁移至感染动物大脑中寄生虫滞留的部位。本方法的可视化演示至关重要。灌注步骤难以掌握，因其既需要速度，又需小心避免损伤重要血管。本实验部分操作的演示者包括：动物技术员莉安娜·麦克伊克（Leanna Mcic）、维多利亚女士（Ms. Victoria）、博士生里克（Rick），以及来自我实验室的博士后研究员莉莎·艾兹博士（Dr. Lisa Aez）。

开始本实验方案时，先将小鼠感染 p. berghei anca。取出冻存的 p. berghei anca 感染红细胞（pRBCs） aliquot，使其恢复至室温以解冻。从笼中取出一只8至12周龄的供体小鼠，放置于工作台上。用拇指和食指抓住小鼠颈部的皮肤。

将小鼠翻转，向其腹腔注射 100 至 200 微升的伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）眼液。通常情况下，需对两只供体小鼠注射 PbCS。注射后，将小鼠放回笼中，于感染后 4 至 5 天进行后续操作。

将供体小鼠从笼中取出，放置于工作台上。取小鼠尾静脉的一滴血，滴于载玻片磨砂端附近。将另一张载玻片以45度角倾斜，从血滴后方推入。

当血液沿边缘扩散后，将推片均匀地推过载玻片以制备血涂片。让涂片自然风干以固定血细胞。将玻片浸入100%甲醇中30秒。

然后将玻片浸入 freshly prepared GIM ZA 染液中染色 10 分钟，GIM ZA 染色后用流水冲洗玻片 30 秒。让玻片自然干燥，随后使用 100 × 油镜在显微镜下观察。计数 1000 个红细胞中的 PRBC 数量，并计算寄生率百分比。若供体小鼠的寄生率已达到 2.5% 至 5% 的要求水平，则在麻醉条件下通过心脏穿刺或使用肝素化毛细管通过眼后静脉丛采血收集供体小鼠血液。

将血液溶解于RPMI培养基中，最终浓度为每只小鼠0.2毫升中含有1×10⁶个PRBC。需注意，正常小鼠的血细胞比容约为每毫升6×10⁹个红细胞。实际上，可通过腹腔注射向8至12周龄的实验用C57BL/6小鼠每只给予0.2毫升含1×10⁶个PRBC的悬液，方法同前。

为了监测感染小鼠的寄生虫血症水平，按之前方法制备血涂片。应从感染后第2或第3天开始，每两到三天检测一次寄生虫血症，自第5天起持续进行。

当寄生虫水平超过5%后，需每天监测小鼠是否出现重症疟疾症状，感染小鼠通常在感染后约第6天出现神经系统症状。通过吸入二氧化碳对感染小鼠实施安乐死，并立即按照随附文件所述用磷酸盐缓冲液（PBS）进行灌注。该操作中最困难的部分是心脏内灌注。

以下是一系列故障排除提示：将小鼠固定在解剖板上的泡沫塑料中，置于解剖托盘内。用70%乙醇擦拭腹部表面，然后使用大剪刀和镊子沿中线切开皮肤以暴露胸腔，将皮肤向两侧翻开并用针固定。

用精细镊子夹住胸骨，剪断膈肌及胸骨两侧的肋骨，切断肋骨。注意不要损伤任何大血管。将胸骨附近的肋骨笼松松地固定在头部旁边。

用精细镊子夹住心室，用精细剪刀小心剪开右心房。将连接重力灌注系统的23号针头插入左心室，方向朝向升主动脉。在PBS运行的同时，仅将针头尖端插入0.5厘米，灌注小鼠5分钟，或直至流出液变澄清。

灌注完成后，解剖脑组织并将其放入含有RPMI培养基的10毫升离心管中。将新鲜获取的脑组织置于培养皿中的40至60目不锈钢细胞筛网上，培养皿内含3至5毫升RPMI组织培养基。将脑组织切成小块。

然后使用晶体冲棒将脑组织小块通过细胞筛滤器。将脑匀浆转移至10毫升离心管中，在4摄氏度下以250 × g离心10分钟。离心后，弃去上清液，并将沉淀物溶解于3毫升RPMI培养基中。

加入胶原酶 D 和 DNA 酶的培养基。室温下旋转孵育 30 分钟。将混合物通过 70 微米尼龙细胞滤网，以去除细胞碎片。

然后在冰上孵育5分钟，接着将样品转移至10毫升离心管中。小心地将脑匀浆液铺加在7毫升30% Percoll垫上，于室温下以400 × g离心20分钟，离心时关闭刹车。弃去上清液后，将沉淀物重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中，再于冰上孵育5分钟。

为了裂解未通过口腔内灌注从脑组织中清除的贴壁型外周血单个核细胞（pbcs），加入9毫升RPMI培养基洗涤细胞，并在4°C下以250 × g离心10分钟。将脑组织中滞留的白细胞或含有BSL的沉淀重悬于50至100微升RPMI培养基中，转移细胞至微量离心管，在显微镜下使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法计数活细胞。

感染后第6天，一旦获得活细胞计数，即可回收20,000至100,000个BSLs。随后将细胞制备用于流式细胞术分析。该操作步骤的详细信息见随附文件，但此处首先进行简要概述。

将从每个脑组织中分离的所有细胞在1.5毫升微量离心管中离心，并用含抗CD16和CD32封闭抗体的染色缓冲液重悬。冰上孵育10分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞，再次离心，并重悬于含有抗CD4、抗CD8、抗TCR和抗NK1.1荧光抗体的染色缓冲液中。细胞于冰上避光孵育1小时，随后用染色缓冲液洗涤并离心。

离心后，将细胞重悬于PBS中，并在流式细胞仪上至少采集5,000至10,000个事件。使用适当的流式细胞术软件分析所得数据。BSL细胞群来自灌注或未灌注、感染疟疾及未感染的对照小鼠脑组织，并用PE标记的抗NK1.1抗体和PC标记的抗TCRβ抗体进行染色。

这些点图显示了灌注或未灌注、疟疾感染及未感染对照小鼠中 NK 细胞、T 淋巴细胞、NK1.1 阳性 TCR 阳性细胞和双阴性细胞（NK1.1 阴性 TCR 阴性）的百分比，结果与既往研究一致。在感染疟疾后第6天经灌注的小鼠脑组织中，αβ TCR 阳性 T 细胞在脑内淋巴细胞（BSL）群体中占比较高。

该细胞群体在未灌注动物的脑组织中明显比例偏低。未灌注脑组织中T细胞频率的表观减少与这些动物脑组织中双阴性细胞的比例和总数显著升高相关。未灌注脑组织中双阴性细胞比例和数量的升高不仅见于疟疾感染小鼠，也见于未免疫的对照组，提示这些细胞是存在于脑血管中的非炎症性白细胞，若未进行心内灌注，便会与炎症细胞一同被回收。

在进行该操作时，重要的是要牢记在器官提取前对感染小鼠进行充分的心内灌注，以避免滞留的白细胞被非炎症性的循环细胞污染。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过流式细胞术分离和分析恶性疟原虫感染小鼠脑内滞留的白细胞。