脑植入微装置及其周围组织的完整组织学表征

本实验的目的是对长期植入啮齿类动物脑组织中的微型装置周围完整的脑组织界面进行成像。首先使用快速凝固硅胶弹性体和双组分牙科丙烯酸树脂覆盖颅骨开窗区域，并在脑内植入装置周围形成颅骨帽，以实现该目标。在对动物进行固定剂灌注及死后组织处理后，通过烧除牙科丙烯酸树脂并切开快速凝固硅胶，将植入脑组织部分的装置与颅骨帽分离。

接下来，取出脑组织并使用切片机进行切片，以在组织切片中完整保留植入物。最后一步是通过洗涤和荧光标记处理组织，然后将组织切片置于光学透明溶液中进行透明化处理，以制备用于荧光成像的样品。最终，利用共聚焦显微镜观察穿透式脑植入物在亚细胞水平上对周围组织产生的完整生物学反应。

与现有的脑切片或取出装置等方法相比，该技术的主要优势在于能够避免破坏附着在植入装置周围及与其粘连的组织，从而完整地观察界面组织。该方法依赖于先进的免疫组织化学和显微镜技术，可获得详细的共聚焦显微镜数据，用以描述脑内植入装置周围区域的结构特征。该方法有助于回答神经假体领域中的关键问题，例如局部细胞死亡、胶质瘢痕形成以及血管重组在多大程度上真正影响脑内植入微电极装置的使用寿命。

尽管该方法可为脑内植入式微电极阵列的长期神经界面提供研究依据，但该方法所涉及的技术也可应用于神经科学的其他研究领域，包括植入式套管或光纤。在通风橱内，佩戴耐热手套，使用镊子和小剪刀小心去除覆盖在丙烯酸颅骨帽周围的皮肤及其他组织，开始操作。使用电烙铁在牙科用丙烯酸材料上开窗，暴露下方的快速密封区域。

该装置应可见地封装在透明的速封胶中。接下来，在手术显微镜下，使用一对弯头显微剪刀切开硅胶弹性体。然后用镊子和显微剪刀逐步去除装置进入脑部位置之前的速封胶小片。

继续沿颅骨开窗表面切割，将连接在多晶硅和颅骨上的装置组件与植入脑组织中的组件分离。切割暴露的装置组件时需小心谨慎，避免在固定组织中推压或拖拽植入物。

然后使用剪刀小心地去除头帽周围的骨骼。接着用刮匙将带有植入装置的脑组织从颅骨上分离。现在将脑组织放入盛有HBHS的玻璃培养皿中。

使用脑块和剃刀刀片对脑组织进行切片，创建一个与植入设备角度相近的平整平面。然后，将两片剃刀刀片穿过脑组织，暴露出将要安装到Vibram上的平整表面。接着，在Vibram平台下方放置一些冰。

然后用纸巾轻轻擦干组织表面。接着，调整样本方向，使最宽的维度与振动切片刀的运动方向平行，以帮助避免刀片可能立即碰倒组织，随后用瞬干胶将组织的平面粘附到载物台上。待胶水固化后，在振动切片槽内向组织周围加入预冷的PBS。

现在使用最大振动频率、较慢的刀片推进速度以及与水平方向成10度的刀片角度，将组织切片切成250至500微米的厚度。然后用毛刷和刮铲小心收集切片，并将HBHS置于4°C的24孔板中保存。在收集切片的过程中，记录每一片切下后放入24孔板中的厚度和位置信息。当Insitu装置可见时，收集一片厚度约为500微米的组织切片。

为了在单个组织切片中完整捕获装置并获取更薄的组织切片，可小心地收集厚度为100微米的切片以接近装置。随后，可收集厚度小于500微米且包含装置在内的组织切片。开始组织处理时，用HBHS缓冲液对切片进行洗涤，每次5分钟，共洗涤三次。

然后将它们在硼氢化钠中孵育15分钟。使用小号油漆刷缓慢翻转切片的每一面，并避免触碰植入装置周围的任何区域。也可配合小号油漆刷使用不锈钢或聚四氟乙烯涂层的微型勺子。

现在用室温的洗涤液对切片进行洗涤，每次5分钟，共洗涤三次。在室温下用洗涤液封闭切片，同时不断翻动切片，封闭2小时。封闭1小时后，将切片在4摄氏度下与一抗孵育约48小时。

接着，用洗涤液快速洗涤六次，每次三分钟。然后用洗涤液洗涤六次，每次一小时。之后，在4°C下用二抗孵育约48小时。

再次进行六次快速三分钟洗涤，随后在洗涤液中进行六次一小时洗涤。然后，移除洗涤液并加入基于甘油的U2 scale透明溶液。用铝箔覆盖培养板，并在4摄氏度下保存。

将厚切片在4°C下透明约一周，或非常厚的组织切片透明两到三周。透明后，使用透明溶液作为封片介质将组织切片封固于载玻片上。用透明指甲油密封所有载玻片，并在避光条件下于4°C保存，使用长工作距离显微镜物镜进行观察。

使用激光扫描共聚焦显微镜或双光子显微镜开始成像。我们将以蔡司 LSM 710 显微系统、Carl Zeiss 软件以及计算机控制的 XY 平移载物台为例，对植入物周围的三维全景进行成像，并针对透明化溶液的折射率进行校正。在本示例中，我们在 Leica Zen 显微镜软件中为 U2 透明化溶液输入 1.4 的折射率值。

该设置会微妙地调整Z轴步进间隔，以补偿设备附近组织中因折射率不匹配造成的影响。使用较低的激光功率（约0.5%至5%）和较大的Z轴步长，粗略评估每个荧光通道在zdi维度上的合适Z轴扫描范围和数据采集参数。然后使用Zen全景软件将物镜定位至最终全景图像的XY中心位置，并确定X轴和Y轴所需采集位置的数量。

为了覆盖您感兴趣的区域，通过快速检查图像序列的第一帧和最后一帧，重新评估并最终确定Z轴采集范围。接下来，手动调整探测器灵敏度和激光功率，使其随成像深度的增加而适当递增。目标通常是保持组织切片不同深度处的图像亮度基本一致，同时避免背景噪声过高。

如有必要，为避免信号重叠，应分别采集每组荧光图像数据，依次运行激光线。调整软件设置以采集数据或透射数据，并使用波长更长、穿透性更强的激光，例如 633 纳米，以捕获这些通道。然后确定合适的激光功率，并设定反射和透射采集的检测灵敏度，围绕植入装置重复相同的采集序列。

最后，导出数据以供后续的定量处理与分析。通过载玻片的任意一侧进行成像，可评估器件周围的界面，例如本图中，从一侧可观察到沿MEA硅基底分布的微胶质细胞，而从另一侧则可观察到沿电极位点和导线分布的微胶质细胞。组织切片封片后，可利用XY平移台进行成像，从而在设定的分辨率下获取整个组织切片上荧光标记的全景图像。

此处，使用钩状物 3,3,3,4,2 标记的细胞核以及用 3,2,9 标记的小胶质细胞单核细胞，同时通过不同通道对 IBA1 抗体进行成像。还采集了透射光和反射光信号，以显示四周植入物相对于钩状物和 IBA1 数据的位置。此处展示的是所有通道叠加后的图像，但包含透射光信息。

可在高倍镜下对植入微型器件周围形态保存良好的组织界面进行详细检查，以分析局部组织反应；利用反射光和透射光可定位器件位置，而荧光抗体或化学标记物则可对完整组织界面沿线的组织成分进行精细成像。在进行该操作时，务必牢记：应充分花费时间仔细地通过头帽分离植入器件，预计此步骤可能耗时长达30分钟以上。观看本视频后，您应能够充分掌握如何采集和处理包含植入器件的脑组织切片。

你还应能够标记并收集描述这些设备周围神经生物学特征的组织学数据。