一种计算机辅助的多电极膜片钳系统

本实验的总体目标是以全细胞模式对多达12个细胞进行膜片钳记录。首先标记每个目标细胞的位置，并为每个细胞分配一根移液管。第二步是定位每根移液管的尖端，并自动将移液管移动至其对应分配的细胞附近。

接下来，每次使用一支移液管接近每个细胞。为了与细胞膜形成紧密的封接，最后一步是破裂细胞膜并进行全细胞记录。最终，通过计算机辅助的多电极膜片钳记录技术，以高分辨率揭示小型神经环路的网络特性。

与现有的手动膜片钳等方法相比，该技术的主要优势在于，可观察到的神经网络连接数量随记录神经元数量的平方而增长。对该技术进行可视化演示非常重要，因为膜片钳操作步骤复杂且需快速完成，因此学习起来较为困难。开始此操作时，应将脑切片放置在显微镜位移范围的中心位置，确保目标区域位于视野中央。

接下来，识别目标细胞。然后根据显微镜坐标系保存细胞的位置。图形界面将显示所选细胞以及微移液管的全局概览，软件会在细胞位置添加标记，并叠加显示在图像上。

此外，会捕获细胞的图像以供将来参考。在选定目标细胞后，通过在图形界面中设置分配控件，指定用于记录各个细胞的移液管。通过选中复选框“显示最终位置”，可预览最终配置的示意图。

现在用细胞内液准备移液管，并将其放置到移液管架上。将头部固定装置放入固定位置，但不要向前滑动。为避免移液管尖端接触浴液，开启正压控制并选择所有移液管。

为确保尖端保持清洁，请轻轻将每个头阶段滑入到位。接下来，在按住按钮 A 的同时按下 R2 按钮，将显微镜定位至切片上方两毫米焦平面的中心位置。对于每个操纵器，请在按住按钮 A 的同时按下 L2 按钮，调用上一次实验中保存的对应位置。此时视野中应能清晰看到移液管的阴影，或沿移液管轴向进行微小移动即可观察到其轮廓。由于移液管形状存在微小差异，需手动进行补偿调整。

接下来，将移液器尖端调至焦点。然后将尖端置于视频显示的红色中心圆点上。在不移动显微镜的情况下，按住控制器上的按钮 C，同时按下 Z 按钮，通知软件移液器已位于显示中心。

在定位单个移液枪头后，将该移液管向后移动，同时按住按钮 a 并按下 L 键，以便定位下一个移液枪头。当所有移液枪头均被精确定位且每个移液管均已分配给对应的细胞后，只需在图形表示窗口中右键单击细胞群的中心位置，并在弹出菜单中选择“cluster”选项，即可自动将各移液管定位至其对应细胞附近。

在簇选项窗口中，选择当前需要定位的所有移液管，然后单击“使用已选移液管开始”。对每个感兴趣的细胞簇重复此操作。执行最终接近时，将移液管相对于细胞的位置设定为：沿移液管轴向距离细胞 200 微米，垂直方向上高于细胞 200 微米，此距离足以使移液管尖端保持在组织之外。

然后等待移液器定位完成。接着，在按住按钮 C 的同时按下 R 键，将显微镜向移液器移动。通过将显微镜聚焦在视频显示区域内移液器尖端的任意位置，并在按住控制器按钮 C 的同时按下 B 键，重新校准每个移液器的位置。此时应短暂出现一个方格网，表示已识别的移液器位置。如果位置不正确，请将移液器尖端对准视频显示中心的圆点，并在按住控制器按钮 C 的同时按下 Z 键。

现在确认当前移液管对应的目标细胞已正确标记，并处于激活标记状态。否则，请移动显微镜，使目标细胞与中央红色圆点对齐，同时按住按钮 C 并按下 Y 按钮以标记该细胞。然后在按住按钮 C 的同时按下 L 二按钮。为将移液管定位至距离其指定细胞 200 微米的位置，显微镜将自动移动至相应位置。调整移液管位置，使其与红色圆点重合。

然后按住按钮 x 的同时，按下 R one 按钮以调整移液器偏移量。在继续按住按钮 x 的情况下，按下 L one 按钮以启动测试脉冲。

随后，缓慢将移液管移至指定细胞。当观察到细胞膜表面出现凹陷时，在按住 Z 按钮的同时按下 Y 按钮，施加短暂的负压，使压力作用于细胞。此时，在按住 x 按钮的同时按下 L 二按钮，应建立约负 65 毫伏的保持电位。

每个细胞形成吉格封接后，通过施加负压开始破裂细胞膜。接着，使用刺激采集系统进行记录。依次对单个细胞施加脉冲或脉冲串，并观察其余细胞的反应，以绘制这些记录细胞之间的连接图谱。

记录完成后，通过右键单击表格中的单选按钮缓慢将移液管从组织中撤回。选择“将移液管撤回 500 微米”，使移液管沿其轴向短距离撤回。随后观察细胞电位的漂移情况，以将移液管完全撤回至初始位置。

将定位速度设置为快速，并重复相同操作，但选择全部选项。通过轻轻滑出头部支架并从支架上拧下移液管，以更换已使用的移液管。以下是单次实验中绘制的直接突触连接网络的示例。

这三个连接图展示了在第五层记录的 12 个锥体细胞，其相应的胞体间距离各不相同。此处为叠加在已记录锥体细胞形态染色图像上的连接图。该图展示了共同邻居效应。

蓝色柱状图表示在采样网络中同时与至少一个其他神经元相连的神经元对。图A显示，具有多个共同邻居的神经元对的互连概率显著增加。在采样网络中，共享多个共同邻居的神经元对出现频率高于随机预期，且神经元对之间的连接概率随着它们共享的共同邻居数量的增加而上升。

这些特性进而形成了小世界聚类网络。该图展示了Martin nty细胞募集的量化结果。此图为一个参数细胞（红色）与Martin nty细胞（蓝色）形成突触连接的图示，而该Martin nty细胞又与第二个参数细胞形成突触连接。

在黑色超阈值刺激下，对参数细胞的刺激会导致Martin nty细胞被募集。通过促进性兴奋性突触后电位的整合，被募集的Martin nty细胞随后抑制第二个参数细胞。该示意图表示对越来越多的膜片钳参数细胞进行刺激及其对另一个参数细胞的影响。

以下是记录到的参数细胞的平均抑制性突触后电位，其值随被刺激的邻近参数细胞数量的变化而变化。在局部环路中，当刺激九个或更多参数细胞时，DYS突触抑制的幅度趋于饱和，且随着被刺激参数细胞数量的增加，接收到DYS突触抑制的细胞比例迅速上升至1。在执行该操作过程中，需注意保持移液管尖端清洁，并在进针阶段避开血管和其他细胞，以尽量减少组织变形。

完成此操作步骤后，可采用其他方法，例如光刺激，以探讨其他问题，如另一种细胞类型对膜片钳细胞的调控作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何加快并完成对多个神经元的膜片钳操作。