利用双层微流控装置揭示电机械调控在组织稳态中的作用

我们施加可控的电场，以研究组织对电学信号的响应，重点关注电流或电场如何调控细胞黏附、增殖和脱落，从而影响组织稳态。我们发现，生理相关电流的方向决定了组织的状态：从顶面到底面的电场诱导了增殖表型，而从底面到顶面的电场则促进细胞脱落，从而可调控整体细胞密度。

尽管定量的生物电研究长期以来一直集中于通过重力趋向性进行迁移，但组织稳态仍难以探究。我们的系统现在能够直接研究生理环境如何调控组织的结构与维持。本方案结合了微流控技术、组织电刺激、结构与力显微镜以及活体成像，以研究电机械调控在组织稳态中的作用。

我们的研究揭示了核心的机电耦合规律。借助新工具，我们现在可以探索内源性生物电信号如何产生并调控组织，以及能否通过调节这些机电信号来控制复杂组织的行为。首先，将一层干净的聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具正面朝上放置于洁净的塑料培养皿盖中，然后缓慢加入500微升液态紫外光固化胶至模具上。

使用刮刀小心润湿所有突出结构，并去除润湿过程中形成的气泡。轻轻将盖玻片压在PDMS模具上，使用实验室擦拭纸去除多余的紫外光固化胶，确保盖玻片的上表面保持清洁和平整。在波长为363至370纳米的均匀紫外光照射下，对结构进行部分固化。

使用75%乙醇擦去任何标记。然后，将结构牢固地固定在平坦表面上，缓慢地将PDMS模具从固化的第一层上剥离。接着，将一块干净的第二层PDMS模具朝下放置在厚度超过2.5毫米的平坦PDMS基板上。

使用镊子从上方轻轻敲击模具的微结构。观察微结构下方界面是否变暗或出现光学对比，以确认接触良好。接着，通过毛细作用将液态紫外光固化胶填充于PDMS模具与平板之间的空隙中。

将结构在紫外光下部分固化 10 秒，操作方式如前所述。使用带有软垫的镊子轻轻将复合紫外光固化胶层和 PDMS 模具从 PDMS 块上剥离。如有必要，可用锋利的剪刀修剪固化胶层多余的边缘。

接下来，将连接在矩形玻璃盖玻片上的第一层放置于平坦表面上。将仍附着在PDMS模具上的第二层与第一层对齐，并用力按压两层，直至特征下方出现阴影。在紫外光下固化对齐后的结构10秒，使第一层和第二层键合形成双层微流控芯片，然后轻轻从键合好的芯片上剥离PDMS模具。

立即用移液器将10微升聚丙烯酰胺凝胶前体溶液滴加到第二层中切口正上方的组织区域中央。轻轻将直径为10毫米的圆形玻璃盖玻片压在液滴上，形成一层平整的凝胶。观察凝胶溶液通过切口流入第一层，并在屏障柱列处停止。

将组装好的微流控芯片立即在紫外光下照射五分钟进行固化。随后，将芯片静置约一小时，使聚丙烯酰胺凝胶充分固化。接着，将微流控芯片置于 pH 7.4 的 0.1 摩尔 HEPES 缓冲液中孵育至少一小时，以水合凝胶并减少凝胶与盖玻片之间的黏附。

然后，用锋利的镊子轻轻将盖玻片从凝胶表面取下。将医用级聚碳酸酯卡盒底部朝上放置于平整表面上，将干燥的芯片反向对准卡盒并贴合。用移液器将紫外光固化胶滴入芯片与卡盒之间的缝隙中，利用毛细作用使胶液充满缝隙，随后在紫外光下固化。

将制备好的微流控装置置于生物安全柜内波长为200至280纳米的紫外光下进行灭菌。在冰上配制所需体积的50微克/毫升I型胶原工作液，溶剂为1X DPBS。在冰上配制Sulfo-SANPAH工作液：取2微升Sulfo-SANPAH储存液（先前溶于无水二甲基亚砜），加入80微升预冷的0.1摩尔HEPES缓冲液（pH 7.4，4°C保存）中稀释。

用实验室擦拭纸轻轻擦拭聚丙烯酰胺凝胶边缘，以在装置内将其干燥。将80微升Sulfo-SANPAH工作溶液用移液器滴加至凝胶表面，确保完全浸没，然后将芯片置于紫外光下照射5分钟以活化Sulfo-SANPAH。用冰冷的0.1摩尔HEPES缓冲液（pH 7.4）冲洗凝胶三次。

通过移液枪将80微升SS工作液加至凝胶上，并在紫外光下照射五分钟，重复Sulfo-SANPAH处理。此次用预冷的1×DPBS缓冲液清洗凝胶三次。最后，向聚丙烯酰胺凝胶上移取100微升I型胶原溶液，确保完全覆盖凝胶表面，并静置一小时。

用 1× DPBS 将未结合的胶原蛋白冲洗三次，然后将凝胶浸没在 1× DPBS 中，直至后续使用。使用螺丝将装置固定到插件上。然后，将最多四个装置插件组件固定到专为安装在显微镜载物台上而设计的支架上。

向每个装置的主孔中加入 2 毫升培养基，并通过废液清除通道冲洗并替换 1X DPBS。然后，将铂电极插入含有 45 毫升培养基的试管中，确保电极完全浸没在培养基中。使用注射器通过Tygon管路抽取培养基，并用夹子夹紧管路。

将充满培养基的管路一端连接到电极室，另一端连接到设备。接着，按照胰蛋白酶消化或细胞悬浮液制备的建议制备细胞悬液，并将10万个细胞接种至主孔中。将装置安装到显微镜上，电极室置于两侧，并将源表连接至电极室。

使用三个通道电阻相同的装置。将其中一个设为对照组。对第二个装置施加从顶端到基底的电流，对第三个装置施加从基底到顶端的电流。

在电流钳模式下获取电信号，并施加20微安的总电流。使用倒置荧光显微镜对整个组织进行成像时，选择20倍物镜。最后，选择561通道用于红色荧光，以及明场通道。

在长时间成像过程中选择一个一小时的时间段。施加垂直于细胞的电刺激，以破坏跨上皮电势，研究其在不同电流方向下对组织行为的作用。在相差成像下，从顶面到底面（ATB）的电流在施加后10分钟内导致细胞连接处变亮，而对照组及从底面到顶面（BTA）的条件则显示对比度低且顶面平坦。

ATB电流在细胞顶面产生向外的凸起。凝胶变形显著依赖于电流方向。ATB电流将凝胶向上拉，而BTA电流则将凝胶向下压缩。

在BTA电流下，连接处E-钙黏蛋白的强度增加，而与对照组相比，在ATB电流下显著降低。连接处肌动蛋白的强度在ATB电流下降低，但在BTA电流下相对于对照组未显著增加。ATB电流引发了跨越单层的多细胞活细胞挤出，而BTA电流则维持了单层结构，与对照组相似。

在ATB电流条件下，细胞分布的空间异质性显著更高，而在BTA和对照条件下则保持较低且均匀的水平。在ATB刺激下，细胞增殖率增加，随时间推移分裂速率更高。相比之下，BTA电流诱导了更多的细胞死亡事件。