基于肽段的功能基序及其结合伴侣的鉴定

本视频展示了一组四个实验，用于鉴定HIV-1 Nef蛋白的功能性基序并开发基于肽的抑制剂。从全长蛋白中发现的基序衍生出的特异性短肽，既能保留其生物学功能，又能竞争性地抑制全长蛋白的功能，从而鉴定出促凋亡基序。在HIV-1 Nef实验中，将Jurkat细胞暴露于Nef扫描肽，随后进行TUNEL凋亡检测，以鉴定能够诱导细胞凋亡的肽段。

另一组含有NEF分泌基序变异的肽段。将分泌修饰区（SMR）与NPH GFP共转染细胞，由于竞争性抑制导致nph分泌减少，通过荧光测定法评估GFP，以鉴定与nef的分泌修饰区（SMR）相互作用的细胞因子。

使用 SMR 野生型 NPH 作为诱饵进行免疫共沉淀实验。最后，为了检测这些相互作用是否影响分泌，将针对已鉴定出的结合伴侣的抗体转染入细胞。通过评估这些抗体是否拮抗 NF 基序的分泌，实验结果鉴定出 NEF 中两个功能性凋亡基序，以及一种可拮抗功能性 NEF 分泌基序及其分泌所必需的细胞结合伴侣的抑制性肽段。

本系列四个实验的总体目标是加速鉴定靶蛋白中的功能基序，并利用这些数据开发针对这些功能基序的多肽类抑制剂。该系列实验方案对我们的研究团队非常有帮助，使我们能够回答与艾滋病发病机制相关的关键科学问题，例如阐明肾脏驱动分泌在发病机制中的作用，以及解析Nef蛋白调控外泌体运输通路的分子机制。今天演示实验操作的是黄明波博士，他是我实验室的研究指导教师。

从一组覆盖本实验感兴趣区域的多肽开始此操作。从艾滋病试剂项目获得了覆盖整个HIV-1 Nef蛋白区域、长度为20个氨基酸且相互间有10个氨基酸重叠的多肽。为鉴定Nef促凋亡基序，可分别使用Nef扫描多肽进行细胞凋亡检测，具体如下：向每个35毫米的Jurkat细胞培养皿中加入含有每毫升10纳克多肽的1毫升培养基，将细胞在37°C条件下培养24小时。

孵育结束后，进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP、生物素缺口标记或TUNEL检测，以评估细胞凋亡。首先用PBS洗涤细胞，然后吸除PBS，加入含4%多聚甲醛的PBS，室温孵育30分钟以固定细胞。固定后，用PBS洗涤细胞，加入Triton X-100，室温孵育10分钟以增加细胞通透性。细胞固定并通透处理后，加入TUNEL试剂，37°C孵育1小时。

用 PBS 清洗细胞两次。然后在计算机控制的落射荧光显微镜系统上测定染色细胞的百分比。按照随附文件所述，使用 Chariot 蛋白递送试剂盒将 JCA 细胞转染 NPH、GFP 质粒以及 SMR 肽的不同变体后，收集培养基，通过荧光显微镜检测转染效率。

采集荧光和明场图像，并确定细胞百分比。为评估NPH GFP分泌的抑制情况，将100 µL无细胞的条件培养基转移至96孔黑色微孔板的各个孔中。使用激发波长为485 nm、发射波长为515 nm的荧光计，以相对荧光单位测量培养基中的GFP荧光强度。

读数完成后，将数据转移至计算机。将对照培养基中的GFP荧光水平设定为100%，然后与共转染了各种SMR肽的细胞培养基中的GFP荧光水平进行比较，以确定NPH GFP分泌的变化。用于分离基序结合伴侣的共免疫沉淀（co-IP）步骤较为困难。

确保在孵育过程中充分震荡磁珠，并在每次洗涤步骤中尽可能去除磁珠中的液体。在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，于37°C条件下，在T75组织培养瓶中培养jerk hat细胞，通过在4°C下以1000 × g离心20分钟收集细胞。用1毫升PBS重悬细胞沉淀，并转移至1.5毫升微量离心管中。

在1000 ×g条件下离心1分钟。然后用1 mL Flag抗体裂解缓冲液重悬沉淀，通过轻柔吹打进行差速微量离心。

在2000 × g条件下离心5分钟，在13,000 × g条件下离心10分钟，分别沉淀细胞碎片和DNA，收集上清液，此后称为裂解液。测定蛋白浓度后，将1毫克裂解液蛋白和1微克SMR野生型或多肽或SMR突变型多肽加入20微升Anti-Flag M2亲和凝胶中。

该亲和凝胶此后称为树脂，用 co IP 缓冲液将混合物调至最终体积为一毫升。同时准备一个阴性对照，其中裂解液与树脂混合，但不加入任一肽段。将混合物在四摄氏度下孵育过夜，同时进行翻转旋转。

次日，将树脂在微型离心机中以5,000至8,000 ×g离心30秒，使树脂沉淀。离心后，静置1至2分钟再处理样品，以使树脂充分沉降至管底。使用细头移液器吸头或Hamilton注射器小心移除上清液，注意避免转移任何树脂。

用洗涤缓冲液将树脂重悬，每次500微升，共洗涤四次，每次洗涤后进行微量离心。为洗脱结合的细胞蛋白，在50微升洗涤缓冲液中加入15微克过量的3×Flag肽至离心管中，室温下在摇床中孵育30分钟，孵育结束后在5,000至8,000×g离心30秒。

静置试管两分钟后，收集并保存含有洗脱蛋白的上清液。通过丙酮沉淀浓缩EITs后，将样品在裂解样品缓冲液中煮沸。然后在40%至20%的Tris-HCl Criterion预制胶上进行SDS-PAGE分离蛋白，再用考马斯亮蓝R-250对凝胶染色。

为评估抗体抑制作用，使用Chariot蛋白递送试剂盒，按照随附文档中的说明，将NGFP与Antifa微管蛋白或抗凋亡抗体共同转染JCA细胞，收集收获细胞后的无细胞条件培养基。取100微升转移至96孔黑色微孔板的各个孔中。然后使用荧光计，在激发波长485纳米、发射波长515纳米的条件下，以相对荧光单位检测培养基中的GFP荧光。

读取酶标板后，将数据转移至计算机，并将抗脂肪微管蛋白对照组的GFP荧光水平设定为100%。将其与共转染抗凋亡抗体的细胞培养基中GFP荧光水平进行比较，以确定HIV-1 Nef蛋白中调控NEF-GFP分泌的凋亡基序。肽扫描分析按本视频所述方法进行。Y轴显示TUNEL标记的细胞百分比，X轴表示处理条件。如图所示，鉴定出HIV-1 Nef蛋白中两个独立的可诱导细胞凋亡的区域，这些区域表现为暴露于Nef肽段的细胞TUNEL标记增加。

凋亡高峰由模体一和模体二表示，用于评估SMR野生型肽对NPH分泌的竞争性抑制作用。将表达GFP标记NPH的克隆与不同SMR肽共转染至JERK CAT T细胞中，收集培养基后检测胞外NPH的分泌水平，通过培养基中GFP荧光强度进行评估。结果显示，含有一个或多个野生型NPH SMR序列模体的肽段可抑制胞外NPH的分泌，而该区域内的任意氨基酸被丙氨酸取代后，肽段的抑制效果显著降低。这表明SMR野生型肽可抑制胞外NPH的分泌；作为对照，采用Nef凋亡模体的11个氨基酸随机序列。此前报道过的一种SMR模体一（SM one），由Sigma Genesis公司提供，用作阴性对照，对胞外NEP的分泌无影响。

该图显示了经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶结果，表明SMR野生型肽段能够共免疫沉淀四种分子量分别为60、65、75和250千道尔顿的蛋白质。作为阴性对照的SMR突变型肽段未能捕获这些蛋白质，且这些蛋白质也不会非特异性地与亲和树脂结合。在不存在SMR野生型肽段的情况下，这些结果提示，所共沉淀的蛋白质是特异性地与SMR野生型肽段中的SMR基序发生相互作用。

酶标仪检测结果显示，将抗mortal抗体与neph表达质粒共转染后，完全抑制了胞外NPH的分泌。无关抗体对胞外ne的分泌无影响。这些结果表明，完整的NM与talent相互作用是胞外neph分泌所必需的。

综上所述，观看本视频后，您应已充分理解如何运用描述性技术来鉴定靶蛋白中的功能基序，并利用这些数据开发针对这些功能基序的肽类抑制剂。在进行共免疫沉淀（co-IP）实验时，关键是要仔细执行孵育和洗涤步骤，确保孵育过程中珠粒充分震荡，并在每次洗涤时尽可能彻底去除珠粒上的液体。此外，在细胞裂解物与树脂洗涤过程中，每次离心后均应让树脂充分沉降。

使用窄口吸头进行四次洗涤，以充分降低背景至可接受水平。