裂分与混合合成及肽类叔酰胺库的表征

本实验的总体目标是演示如何合成含有肽类三级酰胺（PTA）单元的组合化学文库。首先，从天然氨基酸制备PTA亚单体；第二步，在固相载体上合成肽连接区域。

接下来，合成包含PTA和肽亚基的组合库。最后一步是对合成的组合库进行表征，以确保合成质量。最终，合成出含有构象受限PTA亚基的组合库，该库可用于高通量筛选，以获得蛋白质配体并推动新药发现。

因此，本文所涉及的化学方法是在尝试寻找比我们先前研究过的多肽及其他分子更刚性的分子过程中发展起来的。其核心思想是，如果能够鉴定出一系列刚性更强的分子，它们将能够以更高的亲和力与蛋白质靶标结合。我们认为，这对于未来药物的开发，甚至对于发现有趣的探针分子，都具有非常重要的意义。该PTA亚类合成方法的可视化演示至关重要，因为该合成过程难以掌握，其成功与否高度依赖于对温度和时间的精确控制。

首先，将8.9克二烯和11.9克溴化钾加入装有磁力搅拌子的500毫升三颈圆底烧瓶中。然后向烧瓶中加入100毫升预先配制的30%溴化氢溶液。将烧瓶置于-10 °C的乙二醇-干冰浴中，从烧瓶底部通过一根长针通入氩气，鼓泡10分钟。

使用磁力搅拌子以300 RPM的速度搅拌溶液。随后，将预先配制好的亚硝酸钠溶液加入与三颈圆底烧瓶连接的恒压滴液漏斗中，并用隔膜密封。缓慢打开滴液漏斗的阀门，使亚硝酸钠溶液缓慢滴入烧瓶中。

调节阀门，将滴加速度控制在每秒约两滴。亚硝酸钠加毕后，继续搅拌反应液三小时，使温度从零下10摄氏度升至室温。如果溶液颜色过深，可施加真空以除去反应过程中产生的过量氮氧化物及可能生成的溴。

将溶液转移至分液漏斗后，用35毫升二乙醚萃取产物三次。合并有机相，用饱和食盐水洗涤后，收集入烧瓶中，并在硫酸钠上干燥六小时。过滤除去硫酸钠后，在减压条件下蒸发溶剂，得到无色至淡黄色油状物。

使用三比一的正己烷-乙酸乙酯体系通过硅胶柱层析纯化粗产物。进行同位素标记时，将300毫克L-丙氨酸溶解于10毫升重水（D₂O）中，置于50毫升聚乙烯管内。加入10毫克α-酮戊二酸作为共底物后，将反应管加热至37摄氏度。反应完成后，使用1摩尔的氘氧化钠溶液和pH试纸将pH值调节至8.5至8.7。

接下来，向溶液中加入 0.1 毫克丙氨酸转氨酶。将试管置于 37 °C 培养箱中，在 10 至 30 RPM 轻微振荡条件下过夜孵育。此时，在 12 毫升注射器反应器中，将一克 90 微米、10 至凝胶珠用 Ram 连接剂在 10 毫升二甲基甲酰胺中溶胀三小时，并持续轻微振荡，随后从反应器中排出二甲基甲酰胺，并加入 10 毫升 20% 哌啶二甲基甲酰胺溶液，以脱除 Rink 酰胺连接剂上的 Fmoc 保护基团。

将珠子与20% Pepperdine溶液振荡30分钟后，用二甲基甲酰胺洗涤五次，以去除全部Pepperdine。接着，从注射器中取出少量珠子，用氯化铁试验检测。向珠子中加入2毫升2摩尔的溴乙酸二甲基甲酰胺溶液，轻轻振荡。

然后向珠子中加入 2 毫升 2 摩尔的二异丙基碳二亚胺二甲基甲酰胺溶液。用活塞密封注射器后，在摇床中振荡珠子 10 分钟。珠子用二甲基甲酰胺充分洗涤后，向其中加入 2 毫升预先配制的 1 摩尔甲氧基乙基二甲基甲酰胺溶液。

将珠子振荡并用二甲基甲酰胺洗涤五次后，用氯醛试验检测少量珠子。随后，向先前使用的注射器中加入10毫升体积比为1:1的二氯甲烷-二甲基甲酰胺溶液。使用截短吸头的1000微升移液器，将全部1克珠子均匀分装至三个5毫升注射器反应器中。

用氯甲烷清洗三个注射器三次后，将标有 r 和 s 的注射器用无水四氢呋喃各清洗三次，将标有 B 的注射器用二甲基甲酰胺清洗三次。进行溴代丙酸与三苯甲基的偶联反应时，在通风橱内向小瓶中加入约 200 毫克三苯甲基。盖好瓶盖后，称量小瓶中三苯甲基的质量。

然后向小瓶中加入适量的无水四氢呋喃，配制成20毫克/毫升的三光气四氢呋喃溶液。为制备溴代酸三光气混合物，分别向两个小瓶中各加入89微升R-2-溴代丙酸和S-2-溴代丙酸-D4，再向每个小瓶中加入5毫升的三光气四氢呋喃溶液。密封小瓶后，置于-20摄氏度冰箱中冷冻20分钟。

同时，向注射器 r 和 s 中各加入 1,125 微升体积比为 2:1 的四氢呋喃与二异丙基胺混合溶液。另取 356 微升 2,4,6-三甲基嘌呤，分别加入含有冷却的溴代酸光气混合物的各小瓶中，产生白色沉淀。立即将相应的悬浮液直接施加至功能化微珠上，随后将微珠置于摇床中，在 120 转/分钟条件下振荡反应 2 小时。

将5毫升2摩尔的溴乙酸二甲基甲酰胺溶液加入注射器B中，用于溴乙酸与二异丙基碳二亚胺的偶联反应。振荡后，向同一注射器中加入5毫升2摩尔的二丙基碳二亚胺二甲基甲酰胺溶液，并轻轻振荡。随后将注射器B置于与注射器R和S相同的摇床上。在用二氯甲烷和二甲基甲酰胺充分清洗注射器后，将所有注射器振荡2小时。将注射器R、S和B中的全部树脂珠转移至一个12毫升的注射器反应器中。

将珠子用二甲基甲酰胺洗涤五次后，向注射器中加入10毫升体积比为1:1的二氯甲烷-二甲基甲酰胺溶液。使用截去尖端的1000微升移液枪将所有珠子均匀分装至七个独立的2毫升注射器中，随后向对应的每个注射器中加入5毫升预先配制好的2摩尔胺溶液。将七个注射器置于60摄氏度的摇床培养箱中，震荡过夜孵育。孵育结束后进行后续操作。

用二氯甲烷洗涤需要裂解的珠子5次。振荡珠子15分钟后，再用二氯甲烷洗涤一次，然后从注射器中排出二氯甲烷。随后将每颗珠子分别转移至96孔板中。

使用光学显微镜和带有截短尖端的移液枪，将96孔板用盖玻片覆盖，并置于-20摄氏度冰箱中冷冻15分钟。从冰箱中取出板后，向每个含有微珠的孔中加入20微升预先配制并冷却的1:1三氟乙酸/二氯甲烷溶液。重新盖上盖玻片，将96孔板放回-20摄氏度冰箱中的摇床上。

振荡20分钟后，从冷冻机中取出96孔板，揭去盖玻片。通过向各孔吹入空气，将二氯甲烷吹干。当在室温下使用50%三氟乙酸二氯甲烷溶液进行裂解时，可观察到明显的降解现象。

峰593和484分别对应于连接臂和PTA三聚体，表明整个分子已在树脂上成功合成，但在裂解过程中发生了降解。如上所述，在低温条件下进行裂解时，三氟乙酸（TFA）诱导的降解程度显著降低。该裂解机制已在先前文献中有所描述，据信其通过烯胺中间体进行。PTA分子可通过串联质谱（Ms.MS）进行测序，其裂解模式与肽类相似。

使用S-2-溴丙酸和D-4合成的PTA分子在质谱（MS）和串联质谱（MS/MS）中通常产生更宽的峰，这是由于存在未完全反应的副产物，例如S-2-溴丙酸和D-3-壬酸。这一现象可作为测序过程中R手性中心存在的指示。此外，PTA分子比肽类更容易形成加合物，因此建议使用低钠水和塑料实验器具。

另一个可能的副产物是在胺化过程中因溴消除而生成的丙烯酰胺。一旦形成丙烯酰胺，测序即告终止。该问题可通过将伯胺浓度降低至1摩尔以减少溶液中的副反应来解决。

一旦掌握了该方法并建立了适当规模的化合物库，若操作得当，可在两天内完成制备。如今这一化学方法已得到充分发展，且合成效率较高，我希望其他研究人员能够采用这一强大的技术，用于药物研发和探针开发中的构象受限肽模拟物的制备。