基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证

小分子与蛋白质相互作用的鉴定对于药物的研发以及深入理解病毒DTCs相关的病理机制至关重要。该方法可实现对药物识别肽的高通量生物筛选，并对目标小分子药物在蛋白质上的结合位点进行全局性验证。制备QCM传感器芯片时，将陶瓷传感器芯片固定在27兆赫兹QCM仪器的振荡器上，在小分子固定化之前记录空气相中的本征频率。

记录完成后，取下芯片，小心地在传感器芯片的金电极上加入20微升溶于70%乙醇中的一毫摩尔小分子衍生物溶液，以在金电极表面形成自组装单分子层。将芯片置于内衬湿润滤纸的培养皿中，室温下避光孵育一小时，随后用超纯水轻轻冲洗电极表面。用温和的气流吹干芯片，并将其装载到QCM仪器中。

一小时后，记录气相中频率的降低，以测定被固定的 小分子 的量。对于 T7 噬菌体文库生物筛选，将装有专用磁力搅拌子的比色皿置于设定为每分钟 1000 转的 QCM 生物传感器上，并向比色皿中加入 8 毫升反应缓冲液。在缓冲液搅拌的同时，将 QCM 传感器芯片连接至振荡器。压下振荡器的臂，使芯片浸入缓冲液中，并开始监测 QCM 频率。当传感器图谱稳定至频率漂移约为每分钟 3 赫兹时，向比色皿中注入 8 微升 T7 噬菌体文库，并在传感器图谱上标记注射时间点。

监测T7噬菌体结合到固定在金电极表面的小分子上所引起频率降低的现象。10分钟后，停止石英晶体微天平（QCM）频率监测，迅速抬起振荡器以从反应体系中取出传感器芯片，将传感器芯片从振荡器上拆下，并移除芯片上的缓冲液。将干燥的传感器芯片放入湿润的培养皿中，并在金电极上加入20微升对数生长期的大肠杆菌宿主细胞液滴。

将培养皿置于37摄氏度、1000至1500转/分钟的96孔微孔板摇床上孵育30分钟，避光以促进结合的T7七肽噬菌体的回收。孵育结束后，将20微升大肠杆菌悬液转移至200微升LB培养基中。按照常规操作，在培养基中进行噬菌斑分离，并对编码各噬菌体衣壳表面展示的药物识别肽序列的DNA进行测序。

传感器芯片使用后的维护：用含1%十二烷基硫酸钠的溶液浸湿的棉签清洁电极表面，再用超纯水冲洗金表面，并用空气吹干电极。随后，在电极表面加入5微升新配制的Parana溶液，处理5分钟，接着用超纯水冲洗并空气干燥，重复两次。为使用RELIC进行生物信息学分析，请在装有Windows操作系统的个人电脑上解压独立运行的RELIC程序，并在每个文本文件中使用FASTA格式的药物筛选获得的15肽氨基酸序列或单个或多个蛋白质序列。

将所需的文本文件放入 AA-div、info、motif、match、hetero align、fast A con 或 fast A scan 文件夹中。点击独立文件夹中的每个可执行文件，以打开 FTN 95 的个人版本，并在命令行中输入相应的文件名和扩展名，以运行每个程序并获得结果文本格式文件。所获得的结果文本格式文件如下所示。

然后将生成的文本文件导出至电子表格，以绘制使用blow some 62计算得到的信息含量或累积相似性得分的图表。通过该策略，已成功鉴定出六种小分子药物在靶标蛋白上的单个及多个小分子结合位点。例如，通过基于QCM生物传感器的一轮生物筛选，鉴定出29条能够识别以自组装单层形式固定的临床批准药物伊立替康（Irinotecan）的肽段；随后对这29条肽段与乙酰胆碱酯酶进行两两比对，发现特定氨基酸残基的最高得分与构成伊立替康结合位点的残基一致。

在同一类羧酸酯酶的催化三联体附近也成功鉴定了这一相同的肽段亚群，表明这些氨基酸在伊立替康去酯化过程中形成了识别伊立替康的支架结构。识别抗流感药物奥司他韦的27条肽段覆盖了QCM传感器芯片的金电极表面，成功检测到神经氨酸酶中的奥司他韦结合位点。该结合位点由无规卷曲的肽段环组成，这些肽段环在与奥司他韦结合时可能发生动态构象变化。

药物、区域、化学物质、重组噬菌体和细菌均为生物性运载工具，应根据培养增殖规程进行操作。为确保安全，请务必始终佩戴手套、护目镜和实验服。通过该流程，可对多种药物在人体、致病性病毒乃至植物中的靶蛋白进行全局验证，以阐明目标药物的分子作用机制及其潜在治疗效果。