焦磷酸测序用于微生物鉴定与特征分析

以下实验的总体目标是通过使用焦磷酸测序方法对16S核糖体DNA序列进行分析，从而鉴定一种细菌。该过程首先利用生物素标记的引物通过聚合酶链式反应扩增目标DNA。随后，将带有生物素标记的扩增产物利用链霉亲和素包被的磁珠进行固定，并使用洗涤缓冲液进行纯化。

接下来，对扩增子进行变性处理，并将16S核糖体测序引物加入到DNA的单链中。此步骤的目的是为DNA测序做准备。最后，通过焦磷酸测序（pyrosequencing）进行DNA测序反应，这是一种基于“边合成边测序”原理的快速且准确的核酸测序方法。

生物素标记的引物作为DNA聚合酶的模板，逐个掺入脱氧核苷三磷酸（dNTPs），从而生成焦磷酸。ATP硫酸化酶按比例将焦磷酸转化为ATP。ATP驱动荧光素酶介导的荧光素转化为氧化荧光素，产生与ATP量成正比的光信号。该光信号在焦磷酸测序图谱上记录为一个峰，表示核苷酸的掺入。未掺入的dNTPs在添加下一个dNTP以继续合成前，被焦磷酸酶（Apyrase）降解。

在程序上记录的化学发光信号可用于确定DNA序列。所获得的结果为核糖体16S DNA序列，通过与核糖体DNA参考数据库进行比对，可用来鉴定细菌。焦磷酸测序是一种多功能技术，可促进微生物基因组测序，可用于鉴定细菌种类、区分细菌菌株，以及检测导致对抗菌药物产生耐药性的遗传突变。

在本视频中，将演示细菌扩增子生成、扩增子焦磷酸测序及DNA序列分析的操作流程。开始模板扩增步骤时，首先将所有所需溶液解冻并充分混匀。所有操作均可在室温下进行。请根据下表设置PCR反应体系。

请注意，在大多数情况下，终浓度为 1.5 毫摩尔的氯化镁即可获得满意的结果。然而，若需要更高的镁离子浓度，可向反应体系中添加最多 3.5 微升的 25 毫摩尔氯化镁溶液。其中一条引物必须在其 5′ 端进行生物素标记，且建议对该引物进行彻底的高效液相色谱纯化。

轻轻吹打反应混合物使其混匀，然后将适量体积分装至PCR管中。接着，向每根PCR管中加入模板DNA。建议每轮反应加入10纳克基因组DNA。

将 PCR 管放入循环仪中，并在配制总反应混合液之前启动以下循环程序。轻轻旋涡混匀链霉亲和素包被的磁珠溶液瓶，以确保形成均匀的悬浮液。根据以下流程图配制总反应混合液。

在微量离心管中加入磁珠、结合缓冲液和高纯度水。根据所用PCR产物的体积，向PCR板的每个孔中加入60至75微升的主混合液，使每孔总体积达到80微升。向每个孔中加入5至20微升生物素标记的PCR产物。

每孔体积现应为 80 µL。用条形封膜密封各孔，并将 PCR 板置于旋涡振荡器上，于室温下以 1,400 RPM 振荡 5 至 10 分钟。开始该操作时，先用测序缓冲液将测序引物稀释至 0.3 µM，然后向反应板的每孔中加入 25 µL。

将平板置于真空工作站上。根据此示意图填充工作站的槽位：在第一个槽中加入 50 毫升 70% 乙醇，第二个槽中加入 40 毫升变性溶液，第三个槽中加入 50 毫升洗涤缓冲液，第四个槽中加入 50 毫升高纯度水，第五个槽中加入 70 毫升高纯度水。

打开真空泵，并确保真空工具上的开关处于开启状态，以高纯度水冲洗滤膜探针。在第五个槽中，将含有磁珠的PCR板放置于工作站上，确保PCR板和反应板方向一致。将真空工具插入PCR板的孔中。

保持真空开启状态，使用真空工具捕获磁珠，持续20秒或直至所有液体被完全吸出。用70%乙醇冲洗工具20秒或直至所有液体被完全吸出。接着，用变性液冲洗工具20秒或直至所有液体被完全吸出。

随后，用洗涤缓冲液冲洗工具 20 秒，或持续冲洗至所有液体在真空保持开启的状态下被完全吸出。将真空工具抬升至超过垂直 90 度位置，保持 5 秒，使工具内所有液体完全排出。然后关闭泵，将真空工具与三个反应板对齐。

将真空工具插入孔中，然后轻轻左右摇晃约10秒钟，使磁珠释放到含有测序引物的孔中。将真空工具放入水槽中清洗，以使测序引物与DNA结合。

将反应板放入预热的板架中，在 80 摄氏度下加热 2 分钟。从板架中取出反应板，置于实验台上冷却至室温，持续 5 分钟。

开始此操作时，使用电源线正上方的电源开关打开仪器，以确定所需的体积。在仪器软件中设置运行文件，在“工具”菜单下选择“运行前信息”。根据运行前信息页面提供的说明填充一个试剂盒。

将移液枪吸头尽可能深入地插入每个孔的角落，确保无气泡产生。打开 cartridge 样品架的门，将 cartridge 标签朝前插入。确认 cartridge 已正确插入后，关闭门。

打开反应板固定架，将反应板放入仪器内部。关闭反应板固定架及仪器盖。将含有使用仪器软件创建的运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口中。

确认查看所需运行文件的菜单。使用滚动箭头选择所需的运行文件，然后按“选择”按钮。当所有预设的压力和温度条件均达到后，仪器将在运行过程中开始分配试剂。

仪器屏幕会实时显示所选孔的焦测序（pyro）结果。使用滚动箭头查看其他孔的焦测序结果。当仪器确认运行结束且运行文件已保存至U盘后，点击关闭。

取出U盘。此处显示了一次典型焦磷酸测序运行的结果。针对DNA模板（即16S核糖体序列）的保守区域设计了正向和反向PCR引物。

在此示例中，测序引物位于扩增子（以蓝色显示）内一个已充分表征的、用于鉴别的高变DNA序列的紧邻上游位置。该高变序列可用于大量细菌物种的鉴定；同时，利用保守的测序引物作为内部质控，可通过检查可变区两侧的DNA序列，确保所分析的DNA区域正确无误。焦磷酸测序软件可将生成的序列与内部细菌核糖体序列数据库进行比对和序列比对，从而实现细菌鉴定。

此外，还可以分析序列以确定赋予抗生素耐药性的突变。例如，对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）23S核糖体基因中突变的分析揭示了两种赋予抗生素耐药性的突变模式：GAA或GA。焦磷酸测序是一种多功能技术，有助于微生物基因组测序。

焦磷酸测序在微生物学应用中的优势包括快速、可靠地进行高通量筛选，以及准确鉴定微生物和微生物基因组突变。此外，焦磷酸测序方法能够分析抗微生物药物耐药性的全部遗传多样性，包括单核苷酸多态性（SNP）点突变、插入和缺失的分型，以及定量某些抗微生物耐药模式中可能出现的多个基因拷贝。感谢观看本视频，祝您的测序实验顺利成功。