通过焦磷酸测序对线粒体基因组中的单核苷酸多态性进行基因分型

焦磷酸测序是一种基于合成的测序技术，可用于对线粒体DNA中的单核苷酸多态性进行基因分型。与其他测序方法相比，该方法具有操作简便和成本效益高的优势。通过测定线粒体DNA中致病性变异的异质性水平，该技术可便捷地用于某些线粒体疾病的诊断。

首先，获取待基因分型物种的线粒体DNA序列文件，并确定单核苷酸多态性（SNP）的位置。确保所使用的参考序列对所研究的突变采用正确的碱基编号，以便于准确识别SNP位点。复制SNP位点上下游各1,000个碱基对的序列，将截短后的序列粘贴至焦磷酸测序引物设计软件中。

高亮显示多态性碱基，右键单击该碱基，然后选择“设置目标区域”，以将待分析的SNP碱基设定为焦磷酸测序实验的目标区域。点击界面右上角的播放图标，启动引物筛选程序，等待软件自动设计引物三联组：其中两条用于模板DNA的预扩增，第三条用于在焦磷酸测序仪中进行合成测序。右键单击并选择“复制所有引物组合”，以保存全部引物组合。

打开焦磷酸测序仪配套的运行软件，选择“新建检测”，然后选择等位基因定量检测模板。在相应输入框中输入待分析序列，即直接位于测序引物下游的核苷酸序列。对于可变位点，用斜杠分隔表示两种可能的碱基。

按下“生成分配指令”，让软件自动确定在合成测序反应中核苷酸分配的合适顺序。保存并为该检测提供一个名称。接下来，将待分析的DNA稀释至每微升5纳克，以启动运行。

在第一次运行时，务必包含已知异质性的样本作为参考以及野生型样本。然后使用扩增引物和参数对5微升稀释后的DNA进行25微升反应体系的预测序PCR。要运行文件设置，请在焦磷酸测序仪软件中选择“New Run”。

焦测序仪可同时对48个独立的预扩增反应进行测序，焦测序盘上的每个空方格代表一个测序孔。通过右键单击方格并选择“加载检测”来加载检测项目。如有需要，可使用不同的测序引物对最多四个独立的检测项目进行测序。

将引物分配模式设置为自动，以便为运行中使用的所有测序引物自动分配注射室。除非在一张测序盘上同时运行四种不同类型的检测，则将运行模式设为标准模式。确保运行模板文件中的检测数量与正在扩增的PCR反应数量一致。

然后将运行文件保存到U盘。为启动焦磷酸测序仪，按下设备主触摸屏上的清洗按钮，并根据屏幕提示使用高纯度水清洗所有注射器。将吸收条插入仪器时，确保其两端在9点钟位置对接。

插入U盘后，按下“Sequence”按钮以加载先前准备好的运行文件。根据设备上的提示，将所需试剂加载并预灌注到仪器对应的注射器中。向孔中加入3微升微珠，然后将每份需要测序的PCR反应产物各10微升加入对应的样品孔中。

用移液器反复吹打以充分混合样本与磁珠。观察已预热的焦磷酸测序仪，确认出现可加载圆盘的提示。拧开固定板的螺母，将装有样本的样品板与圆盘仓内的金属定位销对齐后放入。

将反应板牢固地旋入反应板仓后，通过触摸屏界面上的启动按钮开始测序运行。运行完成后，从仪器中取出USB驱动器，并将其重新插入运行焦磷酸测序软件的计算机。当新生成的运行文件出现在USB驱动器上后，双击“运行结果”文件。

该系统在核苷酸掺入后自动分析每个孔的荧光素酶信号输出，并定量目标线粒体等位基因。请根据测序读长的质量，查看软件显示的颜色评分。为保存结果，请在顶部窗口选择“报告”（Reports），然后选择“完整报告”（Full Report），以生成包含本次运行中每个孔的焦磷酸测序图谱和结果的 PDF 文件。

或者，在“报告”选项卡下以其他格式下载结果。本图显示了使用针对 m.3243A>G 突变所选两组扩增引物进行 PCR 扩增后，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

此处，Het 表示待分析的接近同质性的 m.3243A>G 样本。该图展示了使用摩尔标准品进行校准的两组引物性能比较。

测量值用垂直的虚线表示。图中显示了 X=Y 的线性函数，用于说明两种被测分析方法各自接近理想测量值的程度。X 轴上的细胞系名称为此分析方法所检测的不同胞质杂交克隆的名称。

此处展示了使用两种检测方法对四个未知 m.3243A>G 异质性的胞质杂交克隆进行基因分型的结果。测序实验在技术上重复了三次。

此处展示了经线粒体锌指核酸酶处理的细胞、未经处理的对照细胞以及模拟处理对照细胞的基因分型结果，以及用于生成这些结果的两个MEF细胞样本PCR重复实验的焦磷酸测序图谱，同时还包括野生型基因分型对照。焦磷酸测序可作为基因治疗实验的一种检测手段，用于评估针对线粒体DNA的各种基因治疗技术。