分离、鉴定及全基因组DNA提取以鉴定菌根异养植物中的内生真菌

本文介绍的技术可用于研究与不同植物器官相关的内生真菌群落。通过分离内生真菌，可对其进行鉴定，并可用于共生萌发等其他技术。首先，准备直径8至10厘米的PDA培养基培养皿，每升添加3毫升抗生素。

使用前将培养基培养皿在36摄氏度下孵育24小时，以检查是否存在污染。次日，采用标准程序对健康的菌根异养植物片段进行表面消毒，并将其置于无菌培养皿中。为评估样品表面消毒的效果，将样品最后一次洗涤时使用的蒸馏水滴加几滴至PDA培养基上进行接种。

接下来，使用灼烧过的手术刀和镊子将样品切成 0.2 厘米厚的片状。切分样品以增大与培养基接触的表面积。将地下器官的五个片段尽可能彼此远离地放置于添加抗生素的 PDA 平板中，且勿接触培养皿边缘。

用保鲜膜密封培养皿，并在25至27摄氏度的黑暗条件下保存五天。继代培养前一天，使用每升含5至7克AA培养基的培养基制备直径为5厘米的培养皿，并在36摄氏度下孵育24小时。为纯化真菌分离物，可根据颜色、生长模式、质地和菌落边缘形态对PDA培养皿上的菌落进行区分。

然后在培养皿底部标记菌落边缘，并用编码标识菌落。用灭菌木质牙签的尖端从已识别真菌菌落的边缘挑取少量菌丝，在AA平板上划线，距离培养皿边缘1厘米处连续划三条平行线，线间相距1厘米。

使用标签纸和铅笔在AA平板上标记相应的代码。将平板密封后，在25至27摄氏度的黑暗条件下培养三天。培养结束后，仔细观察平板，识别形成单个菌落的细小菌丝。

使用永久性记号笔标出单个菌落的范围。用灭菌牙签切取含有菌落的部分培养基，将切下的培养基块转移至不含抗生素的新PDA培养皿中央。用分离株编号标记培养皿后，用保鲜膜密封，并于25至27摄氏度避光培养7至14天。

采用卡斯特拉尼法（Castellani's method）保存真菌分离物时，首先向已灭菌的2毫升微量离心管中加入0.5毫升蒸馏水。使用已灭菌的牙签，从已纯化培养物的菌丝边缘切取0.5厘米×0.5厘米的立方体培养基块。将4至6块培养基块放入盛有蒸馏水的微量离心管中。

将试管避光保存于 25 摄氏度，保存时间根据需要而定。使用时，取出一个方块状培养物，置于新的 PDA 培养皿中央，以培养保存的分离菌株。开始进行压片染色法时，在洁净的玻璃载片上滴加一滴甲苯胺蓝-O 染液。

该技术可使用不同的染色剂。用灭菌的牙签小心地从培养的菌株中挑取一些菌丝，放入染色剂液滴中。盖上盖玻片，在光学显微镜下观察。

对于胶带粘贴法，先在干净的载玻片上滴加一滴乳酸酚棉蓝染液。剪取一段大小适合载玻片及中央染液滴的透明胶带。将胶带的粘性面向下接触菌丝表面，尽量收集少量菌丝，避免用力按压或采集过多。

然后将胶带贴在载玻片上，确保染色面与收集到的菌丝接触。在胶带上滴加一滴水，盖上盖玻片，再置于光学显微镜下观察。将菌异养植物器官片段接种于PDA培养基上5天后，可观察到从片段内部伸出的丝状真菌菌丝体的小群落生长情况。

在纯化分离物接种后的7至14天内，可在PDA培养基上观察到纯真菌分离物菌落呈离心式生长，形成单一的圆形菌丝体。可能的污染易于识别，会破坏菌落在生长形态、颜色及培养基中色素产生方面的均一性。从腐生兰类植物无叶兰（Wullschlaegelia aphylla）的纺锤形根部分离出的一个菌落呈不透明状，培养基中无扩散性色素或渗出物。

菌落上表面呈白色至灰色，下表面呈褐色。菌丝为气生且丰富，菌落边缘不规则且呈气生状。菌落具有绒毛状质地，表面呈皱褶状，无宏观结构。

经过乳酸酚棉蓝和甲苯胺蓝-O对菌丝染色后，原本在未染色菌丝中不易观察的结构得以显现，从而便于鉴定。本文所述的真菌分离方法也可应用于绿色植物，以鉴定其内生真菌。分离得到的真菌可用于共生萌发试验。