通过高尔基-考克斯染色法观察早期积极经验——触觉刺激对树突形态和突触连接的影响

本实验的总体目标是利用高尔基染色技术，观察生命早期触觉刺激后神经元发生的形态学变化。首先，在出生后第3天至第21天期间，每天进行三次触觉刺激；第二步，待动物达到研究所需年龄时，对其进行灌注，并将脑组织保存于高尔迪液中。

接下来，使用Aome对脑组织进行切片。最后一步是采用GOGI共染色技术对脑组织进行浸渍。最终，通过GOGI共染色法可视化单个神经元，从而能够分析其形态学变化。

高伊·考克斯技术的优点在于，它使我们能够量化神经元的结构，并将其与行为结果相关联。该技术的应用意义延伸至发育障碍领域，因为已有研究表明，触觉刺激在这些障碍的行为和解剖学恢复方面均有效。尽管该方法可为大鼠的神经解剖学提供深入见解，但它也可应用于其他模式生物及人类脑组织。

为了帮助我们进一步理解经验依赖性可塑性，动物在出生后被维持在12小时光照-12小时黑暗的循环环境中，并可自由获取食物和水。每只雌性大鼠与其后代单独饲养。为了避免与操作相关的额外应激，幼鼠从出生后第3天（P3）开始接受触觉刺激。

在早晨触觉刺激实验前称量幼崽体重后，将幼崽连同其原代笼具一起转移至独立的测试房间。将原代笼具放置在设定为 24 摄氏度的加热垫上。准备进行触觉刺激时，将母鼠从原代笼具中移出，并放入一个配有食物和水的临时笼具中。

将母鼠和临时笼具保留在繁殖室内。接着，使用一块硬板将鼠笼均分为两个部分。然后，将每窝幼鼠随机分为两组，其中一半接受触觉刺激，另一半作为对照组。

使用永久性记号笔标记其后肢和尾巴，以区分不同组别，并将触觉刺激组的幼鼠放置在笼子的一侧，对照组幼鼠放置在另一侧。使用柔软的羽毛状除尘刷，并设置计时器为15分钟。在同一时间内对触觉刺激组的所有幼鼠进行刷拭，持续15分钟。

幼年大鼠幼崽通常会聚集在一起，并进入深度睡眠周期，这使得同时刺激所有幼崽变得非常容易。随着幼崽年龄增长，它们会变得更加活跃，部分幼崽开始行走和探索周围环境。在实验过程中，应将任何离开群体的幼崽移回群体中，以确保每只幼崽都能接受到均等的刺激。

在触觉刺激15分钟后，将母鼠放回笼中，并将笼子运回繁殖室。该过程每天重复三次。在最后一次触觉刺激结束后连续19天，将幼鼠与母鼠断奶。断奶后的幼鼠按相同性别每5至6只同居一笼，在标准饲养条件下保持不受干扰，直至达到实验所需年龄。

当动物达到100日龄时采集样本。安乐死后进行心脏灌注，取出脑组织，并注意保持小脑完整。

将脑组织置于一个不透光的Nalgene瓶中，瓶内加入20毫升Goldy Cox溶液，保存14天。14天后，更换为30%蔗糖溶液。在切片前，将脑组织在蔗糖溶液中保存2至5天。

在将脑组织固定到切片台上之前，先用吸水纸吸干，使用Sano丙烯酸胶水固定，以防止撕裂或切片不均匀；确保整个脑组织牢固地粘附在切片台上。接下来，用6%蔗糖溶液填充Vibram切片机的储液槽，直至溶液完全覆盖切片刀。将Vibram切片机的振动速度和振幅均设置为5。

将脑组织切成200微米厚的切片，并将切片置于2%明胶包被的显微镜载玻片上。在切片过程中，当所有感兴趣的切片收集完毕后，务必保持切片湿润。用湿润的滤纸轻轻按压切片，使其贴附于载玻片上。

将切片放入切片架中，并在湿盒内保存至少12小时，但不超过四天。开始染色程序时，标记并准备12个玻璃染色缸。首先，将切片浸入蒸馏水中1分钟。

接下来，将载玻片放入氢氧化铵中，并在避光条件下放置30分钟。在蒸馏水中再浸泡1分钟后，将载玻片置于柯达定影液（Kodak Fix）中，避光处理30分钟。再次将载玻片放入蒸馏水中，然后通过一系列梯度酒精溶液进行脱水。

最后一次酒精洗涤后，将玻片放入三分之一溶液中孵育15分钟。最后，将玻片放入Hemo D中15分钟。完成后，使用封片剂（paramount）将盖玻片封固在玻片上，并让玻片在显微镜下观察前自然晾干。

这是一张代表性照片，显示了在发育期间接受触觉刺激的大鼠中经高尔基-考克斯染色的旁中位神经元。放大照片显示了终末树突上的树突棘。左侧较亮的图像来自对照组大鼠，右侧较暗的图像来自接受触觉刺激的大鼠。

该图展示了成年大鼠扣带回第三区域神经元的平均顶端和基底树突复杂性，这些大鼠在发育期间曾接受或未接受触觉刺激。通过采用此方法，我们获得了一个优势：如果需要提出额外的问题，由于我们已经对整个脑组织进行了染色，因此可以回过头来利用同一份脑组织来回答这些问题。通过发展这些技术，我们为研究人员探索触觉刺激在头部创伤或其他形式神经系统损伤治疗中的应用价值铺平了道路。

该技术为神经科学研究人员探索其在修复脑损伤和发育障碍方面的潜力铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何为包裹的幼鼠提供触觉刺激的丰富体验，以及如何对单个神经元和突触进行可视化观察。