使用高尔基-考克斯法对厚脑切片中的神经元进行成像

本实验的总体目标是确定有效处理对啮齿类动物脑内神经元形态的影响。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如啮齿类动物脑内不同区域神经元在正常状态或经实验干预后的形态特征。该技术的主要优势在于能够提高识别和观察完整标记神经元的概率，这些神经元完全包含在单个组织学样本中。

开始高尔基-考克斯染色时，将新鲜的小鼠脑组织放入含有17毫升高尔基-考克斯溶液的20毫升玻璃闪烁瓶中。避光，室温孵育25天。孵育期结束后，将脑组织转移至40毫升蔗糖冷冻保护液中进行冷冻保护，在4摄氏度避光孵育24小时。

在蔗糖中孵育后，脑组织可冷冻以长期保存，或立即进行切块处理以备切片，如视频下一节所示。若需冷冻，请将整个脑组织浸入200毫升已用干冰预冷的异戊烷中。随后将冷冻后的脑组织放入50毫升锥形管中，于-80°C避光保存。

首先，将脑组织从蔗糖溶液中取出。使用剃刀刀片对脑组织进行修块以便切片，切去小脑部分，使剩余脑组织的尾端形成一个平整的切面。脑组织的修块必须保持精确的角度，以确保目标神经元完全包含在最终获得的切片中。

例如，我们采用冠状面，该平面与头尾轴完全垂直，用于大脑皮层的锥体神经元。接下来，加热琼脂至完全融化，然后冷却至略高于其熔点的温度。

然后将脑组织放入一个小型一次性称量皿中，尾端朝下。加入熔化的琼脂以完全覆盖脑组织。待琼脂凝固后，修去多余部分，使脑组织周围保留约2至4毫升的琼脂。

然后使用少量氰基丙烯酸乙酯将脑组织背侧朝下粘附在振动切片机的载物台上。向振动切片机的载物区域加入足量蔗糖防冻剂，以完全浸没脑组织。随后根据待观察的脑区，以400至500微米的切片厚度对脑组织进行切片。

使用小号画笔将脑组织切片放入六孔细胞培养板的孔中，该培养板内含带网底的插入式培养插件，并预先加入蔗糖-M-磷酸盐缓冲液。切片过程中需避光。切片完成后，将组织切片于4°C避光孵育过夜。

使用带网底的插入器，将脑组织切片转移至含有5 mL磷酸盐缓冲液中4%多聚甲醛的新孔中。在室温避光条件下，以低速摇床孵育15分钟。通过将切片转移至含有5 mL水的新孔中，清洗两次。

避光，室温下以中等速度洗涤五分钟。接着，将切片转移至含有五毫升氢氧化铵的新孔板中。室温下避光缓慢振荡孵育15分钟。

将切片转移至含有5毫升水的新孔中，清洗两次。在室温下避光、以中等速度在摇床上清洗5分钟。将切片转移至含有5毫升稀释固定液A的新孔中，在室温下避光、以低速在摇床上孵育25分钟。

将切片按前述方法用水清洗两次。使用小号画笔将切片转移至显微镜载玻片上，然后用镊子和小片纸巾除去多余的水和琼脂。在进行脱水步骤之前，务必确保完全去除所有琼脂。

将切片置于室温下避光自然干燥。适当的干燥时间至关重要，各实验室应自行确定最佳时间。干燥时间过短可能导致切片在脱水步骤中从载玻片上脱落，而时间过长则可能导致切片出现裂纹。

干燥后，先将载玻片放入透明剂中处理五分钟。将载玻片置于100%乙醇中处理五分钟。然后依次经过浓度递减的乙醇溶液，每种浓度处理两分钟。

经过酒精系列处理后，将切片置于水中5分钟。然后用0.5%的焦油紫水溶液染色7分钟。焦油紫染色后，将切片置于水中2分钟。

然后将切片依次浸入浓度递增的酒精中，每种浓度处理两分钟。接着用100%乙醇洗涤两次，每次五分钟。再置于透明剂中五分钟。

最后加入无水封片剂，并在切片上放置盖玻片。将载玻片置于室温避光环境中水平干燥至少五天。为获取包含目标神经元区域的高分辨率图像堆栈，首先在显微镜上选择30X 1.05 NA硅油浸入式物镜。

然后在载玻片上滴加三至四滴硅油浸油。将物镜置于载玻片上方，确保物镜与油滴接触。聚焦图像，并在成像软件中调整相机设置，包括曝光和白平衡。

接下来，通过将焦距调至切片顶部，然后在图像采集窗口中选择“设置为图像栈顶部”，来设定图像栈的上边界。接着将焦距调至切片底部，并选择“设置为图像栈底部”以设定下边界。在图像采集窗口中，于“图像间距离”旁输入1 µm，将步进距离设为1 µm。

最后，在图像采集窗口中选择“采集图像堆栈”以获取图像堆栈。重复前述步骤，以覆盖整个目标区域，确保所有图像堆栈在X轴和Y轴方向上至少有10%的重叠。该大脑皮层图像为使用10倍物镜对500微米厚切片采集的多个图像堆栈合并生成的Z轴投影图像。

本图像中的组织采用全新鲜主要实验方案进行处理。使用30X硅油浸没物镜对红色方框指示的区域进行成像，并获取了高分辨率融合Z投影图像序列。红色箭头所示为从高分辨率30X图像序列中追踪得到的一个神经元的二维Z投影。

此处采用了使用焦油紫染色的新鲜方案变体。该高分辨率图像显示了经焦油紫染色的切片。这是获得的神经元示踪结果。

最后，该组织采用了一种改良方案进行处理，即在高尔基-考克斯浸渍后将脑组织冷冻。此处显示的是先前已冷冻的组织在更高分辨率下的图像。再次获得了神经元示踪的高质量二维Z轴投影图像。

该技术可在一个月内完成，其中处理和成像步骤在最后一周内完成。 alternatively，脑组织可在高尔基-考克斯浸渍后进行冷冻保存，以便在后续时间再进行处理和成像。通过本方案，神经科学家可利用所获取的图像进行详细的形态学分析，例如树突复杂性或树突棘密度，以确定实验干预如何改变脑内神经元的结构。