基于微阵列的单个内源性逆转录病毒位点表达鉴定：在前列腺癌生物标志物发现中的应用

本项人类前列腺癌组织的转录组分析鉴定了个体人类内源性逆转录病毒表达位点，以评估一种定制的高密度微阵列作为生物标志物发现的筛选工具。在医生从患者体内切除前列腺器官后，病理学家在实验室中分别制备肿瘤组织及相邻的正常组织，从中提取、纯化并鉴定正常与肿瘤组织的MR.NA，使用全转录组扩增试剂盒扩增mRNA，然后切割并标记扩增产物。随后依次对H-E-R-V-V2微阵列进行加样、杂交、洗涤和扫描处理。

最终，利用生物计算方法，可以追踪表现出显著信号和差异表达的探针集，从而鉴定出转录活跃的单个基因座。多年前，我们在多种背景下研究了IRV W家族的行为，包括多发性硬化症样本、胎盘和睾丸。

当我们开始了解到，在一个家族中，IRV元件的重叠或非重叠亚群会被表达时，我首次产生了该方法的构想。具体表达情况取决于所处的生物学背景。利用SHIP技术，可以协调地探索多个HER家族，并对每个位点的不同区域进行同步分析。

例如，LTR中的US三和UF结构域可能在病理过程中发挥直接作用。该方法有助于回答癌症研究领域的一些关键问题，例如在前列腺癌诊断中，现有的蛋白质生物标志物（如PSA）缺乏特异性和敏感性。与此同时，非编码RNA（如PCA三）则显示出更大的应用前景。接下来将由病理科技术人员米歇尔演示前列腺组织处理的操作流程。

Philippe Per 将演示 RNA 提取、靶标制备与分析，而来自 John Unit 实验室的一名技术员将演示切片操作。将冷冻组织样本垂直固定于冷冻切片机中 OCT 包埋剂的小丘上。切取单张 5 µm 厚的切片，用苏木精（Blu udine）染色，然后进行快速组织学检查，以评估组织中是否存在肿瘤组织。

评估肿瘤细胞的数量，并仅选择肿瘤细胞比例超过80%的组织芯。再切五微米厚切片，用苏木精、伊红和番红染色。随后切15张30微米厚的切片，转移至无RNA酶的离心管中。

然后取最后一张5 µm厚的切片，用苏木精、伊红和番红染色，以控制肿瘤细胞的数量。操作结束后，将样本置于干冰上转移至分子生物学实验室。将组织置于冰上的Triol溶液中，使用手持匀浆器研磨，直至组织完全溶解。

将样品在室温下孵育5分钟。然后加入300 µL氯仿，涡旋振荡15秒。室温放置2分钟后，在2至8°C下于12,000 ×g离心15分钟。

对于RNA，小心地将上层水相转移至新的离心管中。加入750微升异丙醇，颠倒混匀后于室温孵育10分钟。离心样品以沉淀RNA，再用1毫升80%乙醇洗涤RNA沉淀。

然后在4 °C条件下以7,500 ×g离心10分钟。使用P1000和P10枪头去除上清液。让残留的乙醇自然风干。

接下来，加入 100 微升无 RNAs 水。将样品转移至 70 摄氏度的加热块中。为溶解沉淀，根据制造商说明书，使用生物分析仪和 NanoDrop 检测 RNA 质量及 RNA 完整性。

理想的RNA提取中，RNA完整性数值通常为7或更高。随后按照供应商提供的说明，使用全转录组扩增RNA扩增试剂盒进行操作，然后纯化所得的单链cDNA产物。

根据制造商说明书，使用生物分析仪和NanoDrop检测单链cDNA的产量和片段大小分布。扩增后cDNA的片段大小通常应在101至500个碱基之间，峰值约在600个碱基处，整体呈钟形分布。接下来，向30 µL旋涡中的2 µg cDNA中加入6.6 µL片段化混合液，在37 °C下孵育10分钟以进行cDNA片段化。

然后在95摄氏度下将DNA变性10分钟，随后置于冰上。取1微升片段化的cDNA用于Agilent平台的片段大小分布验证。DNA变性处理可使杂交前cDNA的片段大小分布均一化至约100个核苷酸。

使用生物分析仪Pfizer预润湿试剂检测单链CD NA的片段大小分布。将HERV基因芯片与200微升预杂交液混合，在50摄氏度、60转/分钟条件下孵育10分钟。

在室温下，将131微升杂交混合液加入69微升已片段化并标记的CD NA中，混匀，置于95摄氏度孵育2分钟。随后在50摄氏度孵育5分钟，并以最大转速离心5分钟。现在取出已预湿的HERV基因芯片，加入200微升目标样品进行杂交。

将两个SEPTA上的难处理位点在50摄氏度、60转/分钟条件下杂交18小时。清空HERV基因芯片并加入探针。用250微升洗涤缓冲液处理芯片，在位置一和位置二分别加入600微升SAPE溶液混合物和600微升抗体溶液混合物，在指定位置加入800微升芯片保存缓冲液。

第三步，压下针头。为每个模块分配正确的芯片。选择 FS 4 5 0 0 0 4 协议，并按照软件指示运行每个模块。

在SEPTA上涂抹防漏胶点以防止泄漏。然后将芯片装入自动加载器，或直接装入扫描仪。开始扫描。

扫描芯片后生成点阵CEL文件，检查图像并将网格与斑点对齐，以识别探针细胞。同时对芯片进行多项质量控制检测。随后对芯片数据进行标准化处理，并在标准化后采用层次聚类方法分析数据集。通过显著性分析寻找微阵列实验中差异表达的基因，并对五对匹配的肿瘤与正常前列腺RNA样本进行错误发现率校正。

这导致鉴定出207个具有差异表达值的HERV探针组。对来自其他癌组织的35个额外匹配对样本的进一步分析鉴定出44个前列腺特异性HERV探针组。以下是10个最相关的HERV结构。

最后，可以在一个专用界面中进行功能分析，该界面包含感兴趣的注释序列，以在顶部标识的前10个鉴定出的前病毒结构中选择的一个H-E-R-V-W元件为例，其上方标注了H-E-R-V-V双阵列上存在的特异性探针，并标注了功能性的逆转录病毒区域LTR、gag、POLE N，重点关注五端LTR的U3和U5亚结构域，并据此设计PCR引物用于RT-PCR验证。观看本视频后，您应能充分理解如何掌握样本与靶标制备中的关键步骤，这些步骤是成功应用微阵列进行地球研究以及常规生物标志物发现的质量先决条件。我们设计了一种高密度微阵列，采用ametri格式，旨在最优地表征个体位点的表达情况，以更深入地理解这些位点是否可能具有活性，即在干燥非编码区域NA转录过程中是否活跃，或是否可调控编码基因的表达。

该技术为慢性病和传染病领域的研究人员提供了新的研究方向，因为对活性病毒位点的系统性鉴定可能将遗传、病毒和环境假说统一起来，作为多种病理过程的触发因素。在技术概念验证实验中，若样本数量有限，则成功发现生物标志物可能存在困难，因此需采取预防措施，例如遵循经过统计学验证的工作流程，确保方法的稳健性，并对目标患者人群进行具有代表性的取样。