激光捕获显微切割人前列腺上皮组织用于RNA分析

本激光捕获显微切割方案的总体目标是从异质性的冷冻前列腺组织中分离出纯的前列腺上皮细胞类型的总RNA，用于后续的基因表达分析。该方法有助于分析患者样本，并解答前列腺癌研究领域中的关键问题，例如良性与病变上皮组织样本之间RNA表达的差异，或临床试验样本中的表达特征。该技术的主要优势在于，激光捕获显微切割能够从冷冻前列腺组织中分离出均一的上皮细胞或基质细胞群体，从而实现RNA的提取。

通常，初次使用该方法的研究人员难以获得高质量的RNA，因为他们不了解哪些步骤对于保持RNA完整性至关重要。自由状态条件下，首先收集实验所需的所有试剂和工具。将冷冻的前列腺组织在冷冻切片机中平衡30分钟后，向切片盒底部滴加包埋介质，并使用预冷的镊子迅速将组织固定。

将包埋盒放入冷冻切片机的制冷舱中冷却5分钟，使包埋介质凝固。凝固后，将冷冻的包埋介质滴加到样本头上，小心地将已包埋的组织面朝下压入其中。

让样品静置五分钟。在将样品夹放入 holder 之前，先将手柄锁定到位，并在恒冷箱切片机上安装新刀片。解锁手柄后，小心推进样品，直至达到所需的组织暴露程度。

准备就绪后，将冷冻切片机调整至5 µm，切取一到两片切片。将这些切片置于带电荷的玻璃载玻片上，用于苏木精和伊红染色。立即将载玻片放入冷的100%乙醇中固定2分钟。

此后，取出玻片并在室温下自然干燥。经H和D染色的玻片可更清晰地显示细胞核结构，应由病理学家用于标记感兴趣的区域。接着，放置一个室温的笔架框。

将样本放入切片架中，调节恒冷箱切片机至10微米并进行切片。根据组织大小，每张载玻片可放置1至4个切片。立即将载玻片浸入冰冷的100%乙醇中。

两分钟后取出切片，储存于冷冻箱中以备后续分析。在激光显微切割当天，从冷冻箱中取出笔框切片，在无RNA酶的环境中操作。将切片轻轻浸入90%乙醇中两分钟进行水化，随后再浸入75%乙醇中两分钟。

水化后，将切片轻轻浸入0.5%亚甲蓝溶液中5至30秒，对前列腺组织进行染色。随后将切片用去离子水洗涤两次，每次15秒，再用75%乙醇处理30秒至3分钟。最后，将笔框切片转移至冰上的无RNA酶干燥容器中。

开始实验前，将一张载玻片置于载玻片加热板上干燥15分钟。仅干燥即将处理的载玻片，其余载玻片应保存在冰上直至使用。按以下顺序开启激光显微切割（LCM）系统的各个组件。

显微镜电源、激光钥匙、激光开关，然后是计算机。接下来，使用软件启动激光显微切割系统，提示显微镜加载载玻片和收集管。

单击卸载样本架，将载玻片组织面向下放置到载玻片架上。将载玻片架插入显微镜的相应插槽中，然后单击继续。接下来，单击卸载收集管。

标记试管并将其放入试管架中，然后插入相应的插槽。拧紧管盖，并加入 35 µL 裂解缓冲液，注意避免产生气泡。

装入收集帽后，点击“确定”。使用软件选择载玻片在载物台上的位置，然后选择收集帽以采集样本。通过计算机以10倍放大倍数观察并聚焦载玻片。

使用软件通过选择激光来校准激光。然后通过选择激光，再选择控制，来校准并调节激光的功率光阑和速度。持续进行调整，直至激光完全切透组织。

必须明确标出通常由经委员会认证的病理学家划定的感兴趣区域，以便准确定位并分离出适用于激光显微切割（LCM）的组织区域。使用8英寸×11英寸的苏木精-伊红（H&E）染色病理标记图像作为视觉参考，在软件中利用绘图工具圈选出显微视野中目标上皮区域，避免采集任何间质组织。点击“切割”以启动激光。

如果某个区域未完全切割，可使用移动和切割工具手动重新切割。继续移动物镜至新的视野，并重复激光切割，直至切片被完全分离或收集到所需量的组织。操作完成后，小心地从收集架上取下收集管，并盖上管盖，注意管盖中可能存在的裂解液、缓冲液及组织。

简而言之，离心30秒以使液体和组织沉降至管底。将样本在42摄氏度孵育30分钟，随后于-80摄氏度保存，直至进行RNA提取。这些示例显示了在激光捕获良性上皮细胞类型特异性对照前后，位于笔架式载玻片上的甲苯胺蓝染色前列腺组织切片的代表性图像。

确认激光捕获组织区域的特异性。良性上皮和间质组织不表达前列腺癌特异性基因 A-M-A-C-R。

基质细胞不表达上皮特异性基因和 KX 3.1。在进行此操作时，重要的是要记住在无 RNA 酶的环境中操作，以防止 RNA 降解。观看本视频后，您应能够充分理解如何从冷冻组织中分离上皮细胞或基质细胞的同质群体，并获取 RNA，用于多种下游分析技术。

请务必注意，使用冷冻切片机可能存在极高风险，因此在进行该操作时，必须采取充分的预防措施，例如接受良好的培训，并始终高度注意刀片的安全。