使用多重免疫组织化学染色与多光谱成像定量蛋白质表达及共定位

该方法的总体目标是利用多光谱成像技术对蛋白质表达及共定位进行客观定量。该方法有助于回答基础研究和诊断病理学领域中的关键问题，例如蛋白质在处理干预后或疾病进展过程中表达和定位的变化情况。该技术的主要优势在于消除了传统定量方法中固有的操作者主观性。

开始定量分析时，打开多光谱成像软件，利用先前制备的经单一发色团染色的对照切片以及苏木精染色切片建立光谱库。接着，打开从对照切片获取的图像立方体，选择四到五个阳性染色区域，以光学方式定义发色团。对其他对照切片的图像立方体重复上述步骤，直至创建出包含所有发色团的完整光谱库，然后保存该光谱库。

在多光谱成像软件中新建项目，选择 Multispectral 或 im3 作为图像格式选项，选择 Brightfield 作为样本格式。通过选择“分割组织”、“识别特征”、“表型分析”、“评分”和“导出”来配置项目。如有需要，可更改图像分辨率以加快分析速度。

导入先前创建的光谱库，并选择要包含在分析中的所有染料。通过选择“打开图像立方体”选项，打开要包含在训练数据集中的图像立方体。为确保训练准确性，需选择至少占待分析图像总数18%的图像。

接下来，选择图像的训练集。应包含代表所有疾病状态的图像，以提高分割的准确性。在训练集中纳入大量阴性染色图像，以避免此步骤中产生偏差。

通过选择吸管工具并点击训练集中某幅图像中的白色区域，对训练集图像进行白平衡。点击“下一步”按钮以进入组织分割。然后使用组织分类面板选择要分析的组织类型，以实现更精确的蛋白质组织定位，可选择多种组织类别。

开始创建算法并定义组织类别：使用笔刷工具在训练图像中围绕成组的细胞进行绘制。完成一个组织类别的标注后，对其他组织类别重复此步骤。务必选择图像中能够代表该组织类别类型的典型细胞群。

选择要包含在组织分割器训练中的组件。选择合适的模式尺度以训练组织分割器。然后点击已训练的组织分割器按钮。

观察弹出窗口中显示的正确分类训练区域内的像素比例的准确率。单击“分割图像”以对整个训练图像集进行分割。完成分割后，检查训练集，查找当前训练算法下任何分类错误的组织。

当对组织分割算法结果满意后，点击“下一步”按钮。确保已选择细胞核，以便进一步选择细胞质和/或细胞膜。选择细胞核选项卡，并为细胞核分割选择合适的设置。

然后选择在分割中包含单个还是全部组织类别。选择基于对照染色对象的阈值方法，以采用一种简化的方案获得良好结果。接下来，对可靠的核复染对象选择基于对象的阈值方法。

通过选择“细胞质”选项卡来选取细胞质形态参数。接着，选择细胞核外距离。然后选择最小尺寸。

选择下一个选项组件，其中主选项为“primary”，次选项为“secondary”，并将“select tertiary”作为次级选项。切换到膜标签页，为所用的膜特异性标记物选择“first”。

调整全量程光密度（OD），以确定细胞膜上每种标记物的最低阈值或阳性信号。在“膜”选项卡下继续选择细胞的最大尺寸。完成所有选项的选择后，点击“分割全部”。

应用设置到图像并进行观察。选择“下一步”进入免疫组化评分步骤，并选择要评分的组织类别。选择期望的评分类型，并选择用于评分分析的细胞区域。

接下来，选择查看组分数据，并将光标移至训练图像上，以确定目标组分阳性细胞染色的合适光学密度最低阈值。将训练集数据导出，以测试通过组织分割、细胞分割和评分值所创建的算法，按照提示为导出目录创建新文件夹。选择要生成并包含在分析中的图像和表格。

接下来，选择“全部导出”以执行分析。分析完成后，查看染色程度高和低的图像的细胞分割与评分数据，以评估参数设置的准确性。当对设置结果满意后，单击批量分析选项卡，将算法复制到当前项目中。

然后选择一个新的导出目录，并选取要包含在分析中的图像和表格。在输入文件选项下，选择所有要包含在批量分析中的图像。选择运行选项以执行分析。

完成后，进入“审查合并”选项卡。选择“包含全部”并选择“合并”，以创建包含汇总数据的数据表用于分析。训练在前列腺组织上进行，以将图像分割为上皮和间质部分。

同时包含非组织区域。一组训练图像被导入多光谱成像软件中，用以代表整套图像中的组织类型和疾病状态。通过在训练图像上手动绘制，创建了包括间质、上皮和非组织在内的组织类别，并对这些类别进行了定义。

创建了一种用于组织分割的算法，并将其应用于图像训练集。对组织进行了精确分割。利用多重免疫组织化学技术，尽管存在颜色和形态信号的重叠，仍识别出细胞核表达ER-alpha阳性（呈红色）和AR阳性（呈棕色）的细胞。通过使用E-cadherin（呈黑色）作为标记蛋白，定量分析了CD-147在细胞膜上的特异性表达。

观看本视频后，您应能够充分理解如何定量分析蛋白质表达及共定位，并掌握石蜡包埋组织的处理与固定方法。