使用二蒽醇作为基质在傅里叶变换离子回旋共振质谱仪上进行基质辅助激光解吸/电离成像

该方法可在牛晶状体中实现多种内源性脂质的空间定位。利用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术，首先制备一片薄的牛晶状体组织切片并涂布多种基质，然后采集MALDI质谱成像数据集。

将数据集处理为晶状体组织切片上检测到的脂质的可视化图谱。这些结果共同可用于确定牛晶状体中脂质的定位及其相对丰度，并生成该分布情况的可视化图像。与脂质提取后进行液相色谱-质谱（LCMS）分析等其他方法相比，基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI质谱成像）能够同时可视化多种脂质，且不丢失其空间定位信息。从-80摄氏度保存环境中取出速冻的组织样本。

从晶状体表面移除囊膜，以固定完整的牛犊晶状体切片。在恒温冷冻切片机的组织切削台上滴加一至两滴水。当冷冻切片机达到最佳温度并趋于平衡后，迅速将晶状体放入水中，以防其凝固。

将组织沿赤道方向切成20微米厚的切片。弃去最初的组织切片，仅使用靠近或包含赤道面的切片，用于眼球晶状体组织的成像。加入1.5 µL甲酸以预湿润ITO涂层玻璃载片的表面。

然后在冷冻切片机内将组织切片小心转移至载玻片上。接下来，在应用MALDI基质前，将载玻片冻干15分钟。使用修正液笔，在ITO涂层玻璃载玻片的非导电表面添加三个定位标记。

现在使用平板扫描仪拍摄组织切片的光学图像，并以适当格式（如 TIFF 或 jpeg）保存。首先，用胶带覆盖ITO镀膜玻璃片正面边缘，以防止基质涂布到切片边缘。在适当的溶剂中制备待使用的基质溶液。

然后将基质溶液涂布于组织切片表面。通过使用20个循环的基质涂布来覆盖载玻片。或者，如果溶剂与电子基质喷涂仪不兼容，可使用气动辅助喷雾器来施加基质。

对于质量校准溶液，将ES调谐混合标准溶液用60%异丙醇稀释200倍。以每分钟2微升的流速将稀释后的ES调谐混合溶液引入仪器的双模式电喷雾离子源，用于傅里叶变换离子回旋共振质谱分析。将傅里叶变换离子回旋共振（F-T-I-C-R）仪器在正离子电喷雾电离（ESI）模式下运行，采用宽带检测，数据采集速率为每秒1024千字节。通常将电喷雾电离参数设置为3900伏的毛细管电喷雾电压。

喷雾屏蔽电压为3,600伏，雾化氮气流速为每分钟2升，干燥氮气流速为每分钟4升，温度为200摄氏度。同时将锥孔1电压设为15伏。

飞行时间设置为 0.01 秒，碰撞用氩气流速设置为 0.4 升每分钟，源离子累积时间设置为 0.1 秒，碰撞池离子累积时间设置为 0.2 秒。接下来优化傅里叶变换离子回旋共振（F-T-I-C-R）操作参数，以在质荷比 200 至 1400 的质量范围内最大化分析灵敏度，同时保持良好的时域自由感应衰减信号。然后采集电喷雾电离（ESI）质谱，并使用 E es 调谐混合溶液中标准化合物的参考质量对仪器进行校准。

为了调节仪器以进行MALDI操作，将数份各一微升的混合牛磺酸和INE标准溶液（浓度均为一微摩尔）溶解于基质溶液中，并直接点样到其中一份组织切片上。将载玻片放入组织切片适配器中，并从MALDI侧将适配器装入双ESI-MALDI离子源。接下来，针对每次质谱扫描，优化合适的MALDI操作参数，包括激光功率和用于MALDI信号累积的激光射击次数。

在对仪器进行调谐、校准并优化以用于 MALDI 质谱成像（MSI）实验后，需在成像软件中将待成像组织切片的实际位置与其记录的光学图像对齐。使用三点三角定位法对齐三个修正液标记点。随后启动同步的电喷雾电离（ESI）与基质辅助激光解吸电离（MALDI）操作，使每个质谱图均包含电喷雾（ES）调谐混合溶液的参考质量峰，用于采集后的内标质量校准。

首先通过降低毛细管电压来减弱电喷雾电离（ESI）信号，直至基质辅助激光解吸电离（MALDI）信号在谱图中占主导地位，同时确保ESI校准信号仍足够强，可用于内部质量校准。接着，建立激光辐射的自动递增方法，并采用随机位点分析。

定义需要成像的组织区域，并设置合适的激光RA步长。使用内标法对MALDI质谱进行校准，用于初步比较，并选择峰用于MS/MS去同位素处理，利用自定义的VBA脚本选择单一同位素峰，并导出相应的单一同位素峰列表。将测得的质荷比值输入Melin九或HMDB代谢组学数据库，与数据库条目进行质量匹配。

接下来，使用成像软件并设置峰顶处质量过滤宽度为百万分之一，对在整个组织切片中检测到的所有脂质实体生成 MALDI 图像。一旦生成了与数据库条目匹配的所有质荷比值的图像，还需对所有其他峰也生成图像，以寻找可在后续针对特定组织（如牛晶状体）进行深入研究的独特分布模式。当直接采用解冻贴片法时，组织常出现严重的撕裂现象。

使用乙醇或甲酸对 IT OAS 载玻片进行预处理，有助于在组织贴附过程中保持组织切片的完整性。基质的选择以及溶剂的选取均是影响 MALDI 谱图质量的重要因素。这些示例对比了使用高效基质溶剂与不适宜基质溶剂处理二醇时所获得的谱图结果。

在获取 Maldi 质谱成像实验的一系列质谱数据后，可生成所检测到的每种离子的图像。其中每个像素代表组织切片表面的一个激光照射位点。待测物的相对浓度可在组织切片的不同区域中得以详细呈现。

在大多数实验中，数据会根据每个谱图内的总离子流进行归一化处理。如果不进行此归一化，分析物基质条件更优的区域可能会因COC结晶导致分析物信号更强，从而造成数据偏差。组织制备过程也可能显著改变所生成的图像。

如果样品过于湿润，则分析物会在组织上发生扩散，导致大部分空间信息丢失。本实验以小鼠晶状体组织成像为例，采用二醇作为多重基质，通过傅里叶变换离子回旋共振质谱（F-T-I-C-R-M-S）测定脂质的空间分布。利用二醇或其他基质，可采用类似方法实现不同类型组织中脂质的成像。